丁酸梭菌的生理功效及其在豬業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

張吉鹍

（福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司，福建 廈門 361022）

1 丁酸梭菌的生理功效

1.1 調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進腸道有益菌的增殖，抑制有害菌的生長

動物腸道菌群失衡會引發(fā)各種腸道疾病。丁酸梭菌作為一種厭氧的內(nèi)生芽孢桿菌，比需氧菌更能夠適應(yīng)宿主腸道內(nèi)環(huán)境，從而能更加有效地促進宿主腸道內(nèi)包括嗜酸乳桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、糞桿菌、糞鏈球菌以及乳酸菌等在內(nèi)的益生菌的增殖[1-4]，并能有效地抑制宿主腸道內(nèi)包括葡萄球菌、傷寒沙門菌、腐敗菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、霍亂弧菌、念珠菌以及克雷伯菌的生長，同時還能夠減少吲哚類、硫化氫以及胺類等有害物質(zhì)的產(chǎn)生[5-6]，在宿主腸道內(nèi)起著整腸、治療腸道炎癥、調(diào)節(jié)菌群平衡、促進動物生長的多重作用[7-8]。曹廣添等[5]將丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌按不同的比例混合后進行培養(yǎng)，并與各菌種單獨培養(yǎng)進行比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)36～48 h培養(yǎng)后，聯(lián)合培養(yǎng)組大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌菌數(shù)均顯著低于單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）；當菌數(shù)比例為 1～100∶1 至 100∶1 時，丁酸梭菌對沙門氏菌均有較強的抑菌作用；當丁酸梭菌與其它菌的比例為100∶1時，丁酸梭菌對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用最強；當丁酸梭菌與其它菌的比例為10∶1時，丁酸梭菌對乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖效果最好。聯(lián)合培養(yǎng)8 h后，菌數(shù)比例為10∶1時，丁酸梭菌對雙歧桿菌的增殖效果最明顯。趙熙等[9]的研究結(jié)果不僅驗證了丁酸梭菌制劑可以顯著地增加腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌的數(shù)量，而且還能有效地調(diào)控腸道微生物生態(tài)環(huán)境。由此可見，丁酸梭菌一方面通過促進益生菌增殖，另一方面通過抑制致病菌的生長來校正宿主腸道菌群的失衡，從而改善腸道微生態(tài)環(huán)境，降低腹瀉率、減少腸應(yīng)激綜合征與胃腸炎等疾病的發(fā)生。

正常健康動物糞便所含的菌群，以雙歧桿菌等厭氧菌為主。當動物患病，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)時，糞便菌群中占比較高的雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌的含量減少，而占比較少的潛在致病性菌梭菌卻顯著增加。當患病動物經(jīng)服用丁酸梭菌治愈后，其所排出的糞便中，所含的菌種（如雙歧桿菌、乳酸菌、無芽孢厭氧菌、腸球菌、大腸菌等菌類）及其含量與健康動物相似，主要表現(xiàn)在宿主腸道菌群中占比較高的雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌的比例顯著增加，而潛在致病菌性梭菌的比例顯著下降，臨床癥狀明顯改善[10]。鄭有秀等[11]報道，在（25日齡）斷奶仔豬飼糧中，添加250 mg/kg丁酸梭菌，即可有效抑制斷奶仔豬盲腸大腸埃希菌和沙門菌等有害菌的增殖（P＜0.05），增加乳酸菌與雙歧桿菌的數(shù)量（P＜0.05），綜合考慮包括仔豬腹瀉率在內(nèi)的仔豬生長性能、腸道結(jié)構(gòu)、腸道菌群與免疫功能等各項指標的改善，建議在25～55日齡斷奶仔豬飼糧中丁酸梭菌的添加水平以250～500 mg/kg為宜[10]，但要緩解仔豬的氧化應(yīng)激，丁酸梭菌的添加水平必須到達500 mg/kg[11]。Kuroiwa等[12]發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能與雙歧桿菌、乳酸菌和糞桿菌等腸道有益菌共生，其培養(yǎng)濾液中含有能促進雙歧桿菌生長的因子，能夠促進雙歧桿菌等有益菌的生長；當將丁酸梭菌與致病菌混合培養(yǎng)時，會對弗氏志賀菌、霍亂弧菌與嗜水氣單孢菌的生長產(chǎn)生抑制作用；當將丁酸梭菌與產(chǎn)胺和氨的腐敗梭菌共同培養(yǎng)時，可抑制產(chǎn)胺和氨腐敗梭菌的生長繁殖，從而減少腸道內(nèi)有害的胺與氨的產(chǎn)生，進而減少宿主的中毒或器官的病理性變化。張達榮等[13]采用丁酸梭菌治療腸易激綜合征動物的菌群失調(diào)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療的動物：一方面，其腸道內(nèi)菌群與健康動物無顯著差異，其中尤以雙歧桿菌與乳酸菌的比例增加明顯，而潛在致病性梭菌的比例則顯著下降（P＜0.05）；另一方面，其糞便菌群中的大腸菌、無芽孢厭氧桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌和腸球菌等菌的含量均達到健康動物的標準，其中以雙歧桿菌與乳酸菌的比例增加最為明顯，而具有潛在致病性的梭菌的比例則顯著下降（P＜0.05），臨床癥狀相應(yīng)改善。

1.2 增強免疫功能，預(yù)防腫瘤發(fā)生

丁酸梭菌具有提高機體的免疫力、降低飼料中的抗營養(yǎng)因子的作用。給動物飼喂丁酸梭菌，動物體內(nèi)血清中免疫球蛋白IgA和IgM的含量增加。丁酸梭菌的細胞壁組分及其產(chǎn)生的胞外多糖（半乳糖∶葡萄糖=13.5∶86.5）具有抑制腫瘤細胞生長的作用。用熱滅活丁酸梭菌制成的疫苗能夠激活NK細胞與巨噬細胞。用ELISA法測定攝食丁酸梭菌死菌體（109CFU/g）雞血清中免疫球蛋白IgA的含量，試驗組為6 μg/mL，要顯著高于未攝食菌體的對照組（0.5 μg/mL，P＜0.05）。給雞飼喂添加有丁酸梭菌制劑的飼料后，觀察其血清中ND-HI抗體效價的變化。1周后，供試雞的ND-HI滴度迅速上升。丁酸梭菌還具有抗腫瘤作用。分別給移植肉瘤180前、后小鼠的腹膜注射丁酸梭菌液劑，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌產(chǎn)生的胞外可溶性多聚糖，能夠抑制肉瘤的生長。用熱殺死丁酸梭菌后制成的菌體疫苗，對BDF鼠的B16-F10黑素瘤具有抗轉(zhuǎn)移作用[14]。

1.3 在腸道產(chǎn)生益生產(chǎn)物

1.3.1 酶 丁酸梭菌在動物腸道內(nèi)既能產(chǎn)生多種幫助動物消化的胞內(nèi)酶，又能分泌大量幫助動物消化的胞外酶。這些酶種中主要的有蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶、淀粉酶、脂酶、糖苷酶等，對宿主所采食的營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收具有重要的促進作用。例如，α-淀粉酶能夠水解α-1，4糖苷鍵，從而可以將多糖水解成D-葡萄糖、麥芽糖、糊精和寡糖。β-淀粉酶能夠作用于淀粉的非還原性末端，每次從淀粉大分子上水解下一個麥芽糖分子[15]。在α-淀粉酶與β-淀粉酶的共同作用下，把宿主腸道中的多聚糖轉(zhuǎn)化為低聚糖，為腸道益生菌的生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進其增殖。特別是日本學者Nakajima等[16-17]發(fā)現(xiàn)的丁酸—拜仁梭菌組菌產(chǎn)生的裂解酶與果膠甲基化酶，用于內(nèi)切和外切果膠，將腸道中的果膠酶解為可被雙歧桿菌等益生菌利用、并促進其增殖的中間產(chǎn)物—寡聚半乳糖、4，5-不飽和半乳糖醛酸，最終酶解為可被機體吸收利用的主要由乙酸和少量丁酸與甲酸組成的揮發(fā)性短鏈脂肪酸（SCFA）。這樣動物每天攝入體內(nèi)的大量纖維和果膠物質(zhì)，由于有這些酶系的作用，均能被機體很好地吸收利用。姜芳芳等[18-20]采用Folin酚法測定酶活，就丁酸梭菌C.L24的產(chǎn)蛋白酶條件進行了優(yōu)化，確定了其培養(yǎng)液的最佳碳源是可溶性淀粉，最佳氮源為酵母膏，最佳培養(yǎng)液起始pH為7，最佳培養(yǎng)溫度37℃，最佳接種量為2%，最佳培養(yǎng)時間為48 h。在此條件下，菌株C.L24產(chǎn)蛋白酶的活力最高可達68.46 U/mL，比其初始酶活49.54 U/mL提高了38.2%。

1.3.2 維生素 丁酸梭菌在腸道內(nèi)能夠合成維生素B1（又名硫胺素、抗神經(jīng)炎素）、維生素B2（核黃素）、維生素B3（又名煙酸、維生素PP）、維生素B5（又名泛酸、遍多酸）、維生素B6（吡哆醇）與維生素B9（葉酸）等B族維生素以及維生素K（凝血維生素）等維生素類物質(zhì)，同時還能促進維生素E的吸收，增強動物機體的抗病力，對機體具有保健作用。用對維生素K缺乏高度敏感的家禽進行的試驗表明，丁酸梭菌能夠在腸道內(nèi)產(chǎn)生動物必需的維生素K[4，6]。需要指出的是，丁酸梭菌較其它菌種能夠合成更多的B族維生素，尤其是合成的煙酸是其它菌種的3～6倍[4]。這些維生素可提高飼料的利用率與動物生產(chǎn)性能。

1.3.3 以丁酸為主的短鏈脂肪酸 丁酸梭菌在腸道內(nèi)能夠產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸[19-20]，而以丁酸為主。據(jù)報道，大腸不同部位的腸黏膜細胞均以丁酸作為優(yōu)先利用的主要能量來源，其次是谷氨酰胺與葡萄糖[21]。丁酸等短鏈脂肪酸不僅可以促進有益菌的生長，抑制致病菌的增殖，而且可以作為腸道絨毛生長的直接能量來源或腸道損傷修復(fù)與上皮組織細胞再生的重要營養(yǎng)物質(zhì)，促進腸絨毛的發(fā)育[22]。小腸絨毛長度和隱窩深度等是評價小腸消化吸收功能的重要指標。劉婷婷等[3]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加丁酸梭菌可以提高斷奶仔豬十二指腸及回腸的絨毛長度，降低其隱窩深度，表明丁酸梭菌能夠改變腸道結(jié)構(gòu)，從而提高腸道的營養(yǎng)吸收效率。

2 丁酸梭菌的抑菌作用

2.1 單個菌種的抑菌作用

丁酸梭菌對一些常見有害菌具有抑制作用。唐寶英等[23]研究證明，丁酸梭菌在體外對豬大腸桿菌、雞大腸桿菌與雞白痢沙門菌有較強的頡頏作用。同時丁酸梭菌還能夠抑制霍亂弧菌的生長[8]。Akahashi等[24]將丁酸梭菌Miyairi 588與致病性大腸桿菌O157∶H7共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌不僅可以抑制致病性大腸桿菌的生長，減少類志賀氏毒素（Stx）的產(chǎn)生，并且可以抑制大腸桿菌對Caco-2細胞的黏附；在小鼠模型中，觀察到丁酸梭菌可有效降低致病性大腸桿菌所致的病死率，減少糞便中類志賀氏毒素Stx1和Stx2的含量。王騰浩等[25]的研究表明：青霉素類、頭孢類和四環(huán)素類抗生素對丁酸梭菌ZJU-F1的抑菌作用較強，在飼料生產(chǎn)中不宜配伍；丁酸梭菌ZJU-F1對多肽類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素耐受性較強，在動物生產(chǎn)中可以配伍。

2.2 復(fù)合菌種的抑菌作用

鼠李糖乳桿菌屬于乳桿菌，不僅具有較強的耐酸與耐膽堿力[6]，而且還具有抑制有害菌[27]與抗氧化活性的作用，并且能夠調(diào)節(jié)機體的免疫功能。目前丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌均被廣泛用作飼料添加劑。張玲等[6]的研究表明，將丁酸梭菌與來自于腸道中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌與大腸桿菌等4種致病菌混合培養(yǎng)，可將這些致病菌的菌落數(shù)降低3～5個數(shù)量級，表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；但當丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌組成復(fù)合菌，再與這4種致病菌混合培養(yǎng)，這些致病菌的菌落數(shù)僅降低3～4個數(shù)量級，表明丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌在抑菌方面，不存在正的組合效應(yīng)，也就是無協(xié)同作用。

2.3 飼糧中預(yù)防性地添加丁酸梭菌

目前丁酸梭菌在生產(chǎn)上的使用主要是預(yù)防性地添加到動物飼糧中，但預(yù)防性添加的丁酸梭菌對健康機體在急性應(yīng)激致?lián)p時的應(yīng)用效果鮮見報道，預(yù)防性添加能否幫助健康宿主緩解急性應(yīng)激損傷還有待進一步研究。吳杰等[28]研究了丁酸梭菌對健康大鼠生長性能及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）致急性應(yīng)激大鼠腸道結(jié)構(gòu)、腸道二糖酶活性及腸道炎癥的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.05%丁酸梭菌對健康大鼠的生長無負面影響，給大鼠飼喂預(yù)防性劑量的丁酸梭菌可抑制LPS急性應(yīng)激下LPS對腸道蔗糖酶活性的降低，緩解LPS對腸道黏膜結(jié)構(gòu)（絨毛高度和隱窩深度）的破壞，提高宿主腸道免疫功能，降低腸道炎癥。

3 丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道菌群的作用機制

丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，是多因素綜合作用的結(jié)果，其機理較復(fù)雜，其中一個重要的作用機理就是丁酸梭菌所產(chǎn)生的丁酸梭菌素這種蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)，對梭狀芽孢桿菌等致病菌的殺滅作用。丁酸梭菌素最先由威爾士阿伯里斯特威斯大學學院的Clarke等[29]從丁酸梭菌NCIB7423菌株中分離到，命名為丁酸梭菌素7423，而且是在對數(shù)期生長的丁酸梭菌NCIB7423分泌的丁酸梭菌素最多。Konisky[30]指出，丁酸梭菌素是一種疏水的細菌素，經(jīng)丁酸梭菌處理的細胞，其DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成受到抑制，且其F1F0-ATPase活性也受到抑制，導(dǎo)致ATP濃度降低，細胞內(nèi)的鉀離子（K+）外流。巴斯德梭狀芽孢桿菌經(jīng)過量的丁酸梭菌素處理后，其細胞膜的通透性改變，細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物和一些離子流出胞外。如用丁酸梭菌素處理已吸收銣離子（86Rb+）的梭狀芽孢桿菌，則86Rb+迅速地從細胞內(nèi)流出。在非致死量低濃度丁酸梭菌素作用下，巴斯德梭狀芽孢桿菌的K+外流但不影響膜電勢的變化；在致死或超致死濃度的丁酸梭菌素作用下，巴斯德梭狀芽孢桿菌的膜電勢被消除，K+的主動吸收也被破壞[31]。關(guān)于丁酸梭菌素的分子結(jié)構(gòu)、作用機制及其抗菌譜等，目前還了解得不是很清楚。Kuroiwa等[12]的研究表明，丁酸梭菌之所以能夠促進腸道有益菌的增長，是因為：①丁酸梭菌在腸道中產(chǎn)生的淀粉酶，將淀粉水解成低聚糖，供乳酸菌與雙歧桿菌利用，從而增加了乳酸菌與雙歧桿菌的數(shù)量；②丁酸梭菌不能分解蛋白質(zhì)，因此也就不會產(chǎn)生氨、硫化氫與吲哚等有害物質(zhì)，也就不會引起宿主中毒或器官的病理性變化；③丁酸梭菌增殖快，能夠產(chǎn)生大量有機酸（丁酸、醋酸與乳酸等），降低腸道pH，使有害致病菌生長受限。

4 丁酸梭菌制劑在豬業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1 丁酸梭菌單菌制劑在豬業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

耿正穎等[32]在仔豬飼糧中添加 1×109～5.0×109CFU/kg丁酸梭菌，不僅提高了斷奶仔豬的抗氧化能力與免疫功能，而且提高了仔豬斷奶階段的抗應(yīng)激能力與健康水平。邢帥等[33]給仔豬飼喂添加有0.05%丁酸梭菌的飼糧，不僅改善了仔豬的肝腎功能，緩解了仔豬因大腸桿菌病引起的應(yīng)激，而且增加了血清總蛋白水平，提高了仔豬的生產(chǎn)性能，體現(xiàn)在采食量與日增重的顯著增加。王柳懿等[34]發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加5×1011CFU/kg丁酸梭菌，不僅血清中腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）與白細胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）的含量呈增加趨勢，而且回腸的Toll樣受體2/4（Toll-like receptors 2/4,TLR 2/4）的表達量顯著增加（P＜0.05），特別是處于TLR2/4信號通路下游的接頭蛋白髓樣分化因子（Myeloid differentiation factor 88,MyD88）以及 Toll相互作用蛋白（Toll interacting protein,Tollip）與B細胞淋巴瘤因子3（B cell lymphoma factor 3,Bcl3）的表達量亦顯著增加（P＜0.05）。說明飼糧中添加的丁酸梭菌，激活了TLR2/4信號通路，使仔豬處于免疫激活狀態(tài)，從而提高了機體的免疫力。何婷等[35]的研究證明，生長豬飼糧中的蛋白質(zhì)水平與丁酸梭菌（1×108CFU/kg）的互作能夠調(diào)節(jié)血液脂肪酸的組成，指出在研究豬飼糧中添加丁酸梭菌的效果時，應(yīng)該考慮基礎(chǔ)飼糧蛋白質(zhì)與蛋氨酸水平對試驗的影響。在斷奶仔豬飼糧中添加1×1011CFU/kg的丁酸梭菌可有效增加斷奶仔豬的體增重與飼料轉(zhuǎn)化率[36]，當在添加1×1011CFU/kg丁酸梭菌的基礎(chǔ)上，再添加1×1012CFU/kg的糞腸球菌時，可降低斷奶仔豬的腹瀉率[37]。其可能機制是，添加的丁酸梭菌通過影響腸道微生物及其代謝產(chǎn)物，激活腸上皮細胞的NOD樣受體（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs），進而促進腸上皮細胞的增殖與抗菌肽的分泌以及細胞間緊密連接蛋白、分泌型免疫球蛋白A、調(diào)節(jié)細胞因子的表達，從而提高動物腸道的屏障功能與免疫功能，以維護腸道健康[38-39]。李玉鵬等[40]發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加丁酸梭菌5×108CFU/kg，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡與機體免疫功能，表現(xiàn)在：①腸上皮細胞緊密連接蛋白mRNA的相對表達水平以及血清中抗炎性細胞因子白細胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）的含量顯著增加（P＜0.05）；②血清中促炎性細胞因子白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的含量顯著降低（P＜0.05）；③斷奶仔豬的腸黏膜屏障功能以及機體的抗炎癥反應(yīng)明顯改善（P＜0.05）；④斷奶仔豬的生長性能（日增重）明顯提高（P＜0.05）。

4.2 丁酸梭菌復(fù)合菌制劑在豬業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

凌欣華等[41]報道，在保育豬飼糧中分別添加由丁酸梭菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組成的復(fù)合丁酸梭菌制劑（含活菌數(shù)≥4×1012CFU/kg）2×109CFU/kg（低劑量的 A 組，500 g/t）、2×109CFU/kg（高劑量組的B組，1 000 g/t），并與由桿菌肽鋅+硫酸黏桿菌素組成的復(fù)合抗生素組（1 000 g/t）C及既不添加復(fù)合丁酸梭菌制劑又不添加復(fù)合抗生素的空白對照組D進行對照，考察復(fù)合丁酸梭菌制劑防治仔豬腹瀉的效果，發(fā)現(xiàn)在試驗的第1～16天，低劑量復(fù)合丁酸梭菌制劑組A的腹瀉率比空白對照組D降低 45.68%（P＜0.05），高劑量復(fù)合丁酸梭菌制劑組 B的腹瀉率比空白對照組 D 降低 51.44%（P＜0.05），但組A與組B的差異不顯著（P＞0.05）。在試驗的第1～30天，組A的腹瀉率比組D的降低52.05%（P＜0.05），然而，盡管組B的腹瀉率僅比組D的降低37.22%，但差異顯著（P＜0.05），而組 C 的腹瀉率比組D 降低 64.15%（P＜0.05），但是組 A、組 B 與組 C 之間差異不顯著（P＞0.05）。該試驗表明，在仔豬飼糧中添加復(fù)合丁酸梭菌制劑2×109CFU/kg（500 g/t）就能達到2倍劑量（1 000 g/t）復(fù)合抗生素防治仔豬腹瀉的效果。楊玲等[42]分別用復(fù)合益生菌制劑（含丁酸梭菌≥5×108CFU/g、地衣芽孢桿菌≥1.5×1010CFU/g、枯草芽孢桿菌≥1×1010CFU/g、嗜酸乳桿菌≥1×108CFU/g）替代斷奶仔豬飼糧中0、50%、100%的抗生素（金霉素75 mg/kg+桿菌肽鋅40 mg/kg+吉他霉素50 mg/kg），結(jié)果表明，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，可用含有丁酸梭菌的復(fù)合益生菌替代抗生素，且以100%替代效果最好。