自噬及其在缺血性腦中風(fēng)中雙重作用的研究進(jìn)展

正常細(xì)胞受饑餓、衰老和蛋白錯(cuò)誤折疊或聚集等因素的誘發(fā)，為應(yīng)對(duì)胞內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激變化，維持自身穩(wěn)定，細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象[1]。然而，當(dāng)自噬(autophagy)的水平超過細(xì)胞所能承受的限度，則會(huì)引起細(xì)胞過度損傷甚至死亡。通常，陳舊蛋白及受損細(xì)胞器主要通過自噬降解，而短時(shí)作用蛋白則通過泛素-蛋白酶體途徑降解，二者共同維持細(xì)胞存活[2]。隨著對(duì)細(xì)胞自噬認(rèn)知的不斷提高，自噬的生物學(xué)作用與損傷神經(jīng)元功能修復(fù)方面的聯(lián)系逐漸顯現(xiàn)出來，自噬與腦中風(fēng)的康復(fù)治療隨即受到基礎(chǔ)或臨床醫(yī)學(xué)的普遍關(guān)注。

腦中風(fēng)是一種由腦組織缺血及出血導(dǎo)致的以神經(jīng)功能缺陷為主要臨床表現(xiàn)的急性腦血管病。該疾病具有三大特征：發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，我國每年有約800萬腦中風(fēng)新發(fā)病人，年死亡人數(shù)超過200萬，且年增長速率高達(dá)8.7%，其中約70%的病人因?yàn)槟X中風(fēng)造成神經(jīng)功能嚴(yán)重缺陷不能獨(dú)立生活，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，加重家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[3]。在腦中風(fēng)病人中，約80%為缺血性腦中風(fēng)，又稱缺血性腦損傷。當(dāng)前僅有纖維組織酶原激活劑(tissue plasmagrn activator，tPA)為有效的治療藥物，但僅3 h的給藥時(shí)間窗及嚴(yán)重的副作用如出血等，極大地限制了tPA的廣泛應(yīng)用[4]。此外很多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中找到的神經(jīng)保護(hù)藥物在臨床上均未獲得理想的效果，顯示出嚴(yán)重的毒副作用。最近研究顯示，自噬是一種可逆性的細(xì)胞死亡，通過針對(duì)自噬的藥物治療可明顯提高腦中風(fēng)梗死半影區(qū)的細(xì)胞存活，并可顯著改善腦中風(fēng)后的神經(jīng)功能恢復(fù)。因此深入探究自噬對(duì)缺血半影區(qū)損傷神經(jīng)元的修復(fù)作用及其調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而尋求有效的神經(jīng)保護(hù)方案顯得尤為重要。本文重點(diǎn)討論自噬對(duì)神經(jīng)元存活的影響，以及自噬在腦中風(fēng)后的神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)損傷作用。并討論干預(yù)自噬提高腦中風(fēng)后神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制，為研究自噬在腦中風(fēng)后的病理及藥理機(jī)制提供參考。

1 自 噬

自噬即指細(xì)胞的自我吞噬，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)外界環(huán)境應(yīng)激變化而引發(fā)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。在不同的條件下，自噬可發(fā)揮不同的效應(yīng)。一方面，細(xì)胞通過自噬降解細(xì)胞陳舊蛋白質(zhì)、損傷細(xì)胞器等實(shí)現(xiàn)自我更新，同時(shí)釋放氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)等緩解組織內(nèi)的能量供應(yīng)短缺，提高損傷細(xì)胞的存活率。另一方面，當(dāng)自噬過度激活或自噬不足時(shí)，則引發(fā)自噬應(yīng)激，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，擾亂細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞器損傷，如觸發(fā)線粒體死亡途徑等，引起自噬性細(xì)胞死亡，即Ⅱ型程序型細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，對(duì)細(xì)胞有害，并參與多種疾病的致病過程[5]，與另一種Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡有所區(qū)別，所以說自噬在疾病中有雙重作用。

1.1 自噬的分類 按照生理功能和細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送至溶酶體內(nèi)被降解方式的差異，可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)。巨自噬是指雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體(autophagosome)先包裹細(xì)胞需要降解的廢棄物，并通過與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體(autolysosome)，而后溶酶體酶使物質(zhì)循環(huán)再利用。在生理狀態(tài)下，巨自噬已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中具有保護(hù)作用，是通常所指的自噬過程。微自噬是指溶酶體本身膜形變?yōu)槿苊阁w內(nèi)膜泡，直接吞噬胞質(zhì)、內(nèi)含物和細(xì)胞器的方法。CMA是指胞質(zhì)內(nèi)蛋白最初與分子伴侶如熱休克蛋白70(hot shock protein，HSP70)結(jié)合后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，繼而被溶酶體酶消化。雖然這3種主要方式發(fā)生過程不同，但在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有共同的作用。

1.2 自噬的發(fā)生周期 具體來說自噬的產(chǎn)生周期可人為地將其分為自噬膜的誘導(dǎo)、自噬體的形成、自噬體的運(yùn)輸、自噬體的降解4個(gè)階段，是一個(gè)高度調(diào)控的多步驟進(jìn)程，其中最為關(guān)鍵是自噬體的形成。①自噬膜的誘導(dǎo)：在饑餓、缺血缺氧和生長因子缺乏等上游信號(hào)的刺激下，自噬前體由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體參與包裹降解物而形成。通過識(shí)別機(jī)制的不同將這一階段分為有選擇性和非選擇性兩種自噬，前者由細(xì)胞內(nèi)的底物誘導(dǎo)發(fā)生，而后者由細(xì)胞外的刺激發(fā)生。②自噬體的形成：分隔膜經(jīng)過延伸和彎曲構(gòu)成 “C”形至“O”形的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，其直徑一般在500 nm左右，此過程受微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)和自噬相關(guān)基因5-12兩種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的調(diào)控。③自噬體的運(yùn)輸：自噬體通過自身的運(yùn)輸與溶酶體結(jié)合形成單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。④自噬體的降解：通過溶酶體中的酶消化分解，使自噬體膜分離，并且將有用的產(chǎn)物如氨基酸、核苷酸等輸送到胞漿中循環(huán)利用。

2 自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用效應(yīng)

細(xì)胞自噬不同于壞死和凋亡，它可以讓細(xì)胞獲得再生的機(jī)會(huì)。由于大部分神經(jīng)細(xì)胞不能分裂，對(duì)于神經(jīng)元這類不可再生的細(xì)胞來說，這個(gè)過程尤為重要，多數(shù)細(xì)胞器的更新依賴于自噬機(jī)制。分化完全的神經(jīng)細(xì)胞，想要通過其他方式來恢復(fù)自身功能幾乎是不可能的，倘若自噬相關(guān)基因發(fā)生突變則細(xì)胞必將受損直至死亡。例如將小鼠的自噬相關(guān)基因Atg5敲除，可導(dǎo)致大量蛋白聚集在神經(jīng)元，自噬功能異常，出生后的幾小時(shí)內(nèi)小鼠便死亡[6]。此外，神經(jīng)細(xì)胞自噬不僅實(shí)現(xiàn)自我消化，而且也為周圍細(xì)胞提供原料，使細(xì)胞對(duì)抗外界不利因素的適應(yīng)能力大大提高。研究表明，自噬功能缺失與缺血性疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、炎癥和免疫性疾病密切相關(guān)。

3 缺血性腦中風(fēng)后自噬研究的基本方法

3.1 自噬的檢測 累積的證據(jù)表明，缺血性刺激后，自噬在腦組織或神經(jīng)細(xì)胞中被激活。主要通過電子顯微鏡觀察法、免疫印跡、免疫組化、免疫熒光檢測，從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方面提供單個(gè)或組合的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

自噬的檢測方法分為直接法和間接法兩種形式，前者在于觀察自噬的形態(tài)，后者則是檢測自噬表達(dá)的特征蛋白。1995年，Nikoletopoulou等首次通過電子顯微鏡觀察到雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的沙土鼠大腦海馬CA1區(qū)的自噬現(xiàn)象[7]。直到現(xiàn)在，準(zhǔn)確地對(duì)自噬體進(jìn)行定位、定性甚至定量檢測，一直是檢測自噬的金指標(biāo)。MAP1-LC3 是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳動(dòng)物中的同源物，作為自噬體形成的標(biāo)志性蛋白，其在組織中以胞漿型(LC3-Ⅰ)和膜型(LC3-Ⅱ)兩種形式存在，因此，想要觀察自噬水平的增強(qiáng)和減弱可采用Western Blot 技術(shù)分析LC3-Ⅱ/Ⅰ的灰度值[8]。Beclin1 是另一種檢測自噬的起始標(biāo)志物，這種自噬相關(guān)蛋白與酵母中Atg6同源。不同的是P62蛋白在自噬過程作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，也都在研究缺血性腦中風(fēng)中作為自噬的常用指標(biāo)。除此之外，還有單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色法、吖啶橙(acridineorange，AO)染色法和熒光顯微鏡法，是基于自噬原理的特殊染色方法。

3.2 自噬的調(diào)控 細(xì)胞在正常情況下，自噬的表達(dá)水平較低，然而當(dāng)神經(jīng)元受到過多的外界刺激，就使得基礎(chǔ)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)自噬[9]。而在缺血性腦卒中的研究中自噬的誘導(dǎo)常常需要加入自噬的抑制劑和激活劑作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)比驗(yàn)證。

主要影響自噬的調(diào)控機(jī)制大致分為磷酸肌醇三磷酸激酶(PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)、GAI3 蛋白和氨基酸、激素等[10]。這其中Ⅰ型PI3K和哺乳動(dòng)物TOR(mTOR)作為抑制自噬信號(hào)的通路，而PI3K通路的Ⅲ型則作為激活自噬信號(hào)的通路。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、渥漫青霉素(Wortmannin，WM)和LY294002是研究者普遍使用的自噬抑制劑，它們都可以阻止或影響自噬體的形成，這其中最為理想的抑制效果是3-甲基腺嘌呤，作為Ⅲ型PI3K通路的抑制劑。值得關(guān)注的是，有研究表明，3-MA對(duì)自噬具有雙重作用，在營養(yǎng)充足下，3-MA能促進(jìn)自噬的發(fā)生，而在細(xì)胞饑餓條件下抑制自噬的發(fā)生[11]。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)和長春堿用于阻斷自噬體與溶酶體的融合，E64d作為蛋白酶抑制劑則參與抑制溶酶體的降解。雷帕霉素(rapamycin，RAP)是mTOR的抑制劑，有助于Atg13的去磷酸化和其他自噬相關(guān)基因的活化，促進(jìn)自噬的發(fā)生，是一種廣泛應(yīng)用的自噬激活劑[12]。

4 自噬與缺血性腦中風(fēng)

在大量缺血性腦中風(fēng)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，腦缺血可顯著激活細(xì)胞的自噬活性，并可通過藥物干預(yù)調(diào)節(jié)。由于自噬在缺血性腦中風(fēng)后受細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度、缺血時(shí)間長短和缺血腦區(qū)部位等多種因素的影響，自噬在腦中風(fēng)后的作用效應(yīng)不盡相同，甚至截然相反。通過檢索新近文獻(xiàn)，自噬在腦中風(fēng)后的作用歸納如下。

4.1自噬在缺血性腦中風(fēng)的保護(hù)作用 在腦缺血發(fā)生的早期，為應(yīng)對(duì)神經(jīng)元的損傷，自噬體運(yùn)載其內(nèi)容物從軸突運(yùn)輸至胞體，與溶酶體融合后，清除受損神經(jīng)細(xì)胞，保護(hù)周圍的神經(jīng)細(xì)胞，維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，自噬被稱為神經(jīng)元的“管家”，輕度或中度激活自噬可提高神經(jīng)細(xì)胞生存[13]。Jiang等[14]在大鼠永久性缺血前進(jìn)行缺血預(yù)處理，當(dāng)加入用載體化合物C(AMPK抑制劑)或自噬抑制劑3-MA后，腦梗死體積增加，神經(jīng)損傷嚴(yán)重，表明提高自噬有助于缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)。Zhou等[15]分別建立了大鼠局灶性腦缺血體內(nèi)動(dòng)物模型和氧糖剝奪(OGD)體外細(xì)胞模型。通過腹腔注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素增強(qiáng)自噬，結(jié)果顯示，腦梗死體積、腦組織中丙二醛、過氧化物歧化酶和細(xì)胞色素C水平顯著下降。相反，海馬神經(jīng)元OGD 模型用3-MA 抑制自噬后，原代海馬神經(jīng)元損傷明顯加重。由此推測，自噬對(duì)缺血性腦中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。Wei等[16]建立小鼠大腦中動(dòng)脈誘導(dǎo)的缺血性腦中風(fēng)實(shí)驗(yàn)說明，神經(jīng)元特異性常規(guī)蛋白激酶C(cPKC)γ通過Akt-mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬的升高，改善了缺血性腦卒中后小鼠的神經(jīng)學(xué)結(jié)果。Yan 等[17]實(shí)驗(yàn)得出高壓氧預(yù)適應(yīng)與自噬激動(dòng)劑雷帕霉素具有相似的功能， LC3-Ⅱ以及Beclin1 的自噬蛋白表達(dá)升高后腦損傷減少，3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，腦損傷則加劇。值得關(guān)注的是，另有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素在腦缺血的初期保護(hù)作用顯著，但在腦缺血末期其保護(hù)效果顯著降低[18]。

4.2 自噬在缺血性腦中風(fēng)的損傷作用 但也有研究者提出相反的結(jié)論，在營養(yǎng)匱乏、毒性刺激和低氧等應(yīng)激因素的刺激下，細(xì)胞的自噬活性明顯增強(qiáng)，當(dāng)超過細(xì)胞所能承受的范圍時(shí)，眾多的自噬底物在軸突中積聚，迫使溶酶體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突，從而使軸突運(yùn)輸功能紊亂，最后導(dǎo)致神經(jīng)元受損，因此過度的激活自噬促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞大量死亡[9]。Dong等[19]用Nissl染色顯示，接受Ro25-6981治療的大鼠海馬CA1錐體層神經(jīng)元損傷減少，降低雷帕霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和缺血再灌注后自噬的過度激活，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。Wang等[20]研究建立了大鼠遠(yuǎn)端缺血期處理和缺血后處理結(jié)合模型，通過抑制自噬減弱了血漿HMGB1水平，腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用明顯，而加入自噬激活劑雷帕霉素?fù)p傷增強(qiáng)。Yang等[21]通過永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(pMCAO)在小鼠中構(gòu)建了局灶性腦缺血模型，檢測到體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的自體吞噬和炎癥反應(yīng)，使用藥物抑制劑3-MA抑制自噬不僅降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬和炎癥反應(yīng)，而且降低了腦梗死面積，減少了水腫形成和神經(jīng)缺陷，表明腦缺血誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬增強(qiáng)缺血性神經(jīng)炎癥和損傷。Luo等[22]用右旋美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)和3-MA后處理對(duì)于用雷帕霉素處理的短暫動(dòng)脈閉塞(tMCAO)模型相比較，抑制缺血周圍腦組織的神經(jīng)元自噬可以減少腦梗死面積并改善神經(jīng)功能缺陷，增加氧糖剝奪模型中原代培養(yǎng)神經(jīng)元的活力和凋亡，這表明在再灌注開始時(shí)抑制神經(jīng)元自噬，可以保護(hù)小鼠腦免受缺血再灌注損傷，有助于提高受損神經(jīng)元的存活。

4.3 自噬和缺血性腦中風(fēng)相關(guān)研究的總結(jié)分析 越來越多的研究證實(shí)，自噬在缺血性腦中風(fēng)后的作用十分顯著。而在腦缺血前進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)可挽救自噬造成的腦缺血損傷，其與缺血性腦卒中自噬發(fā)生的時(shí)間及程度有所區(qū)別。盡管目前關(guān)于腦缺血后自噬對(duì)神經(jīng)元是保護(hù)還是損傷仍然眾說紛紜，其可能存在的機(jī)制包括：以降解神經(jīng)突觸為神經(jīng)元提供能量；降解受損的線粒體從而抑制凋亡發(fā)生；降解能量消耗來緩解細(xì)胞死亡[23]。但可以確定的是在腦缺血的初期，自噬的激活是對(duì)外界環(huán)境變化的一種適應(yīng)性反應(yīng)，并作為一種防御機(jī)制；而隨著自噬的增加，如在腦缺血的末期，神經(jīng)元損傷則以凋亡和壞死為主，原因在于自噬的保護(hù)作用及損傷作用在不同條件下可能會(huì)相互轉(zhuǎn)化。使用化學(xué)藥劑對(duì)自噬的非特異性和單一方法監(jiān)測動(dòng)物腦缺血模型自噬的可靠性等都會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致，使得必須避免動(dòng)物模型個(gè)體差異的影響，設(shè)計(jì)多個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)[24]。 Sadoshima 等[25]歸納總結(jié)：適度自噬可可提高缺血性腦中風(fēng)后的神經(jīng)保護(hù)作用，而過度自噬加劇缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)損傷。

5 展 望

自噬參與多種生理和病理過程。雖然自噬在缺血性腦中風(fēng)的確切作用還存在爭議，但可以確定的是，自噬可調(diào)節(jié)腦缺血半影區(qū)損傷神經(jīng)元死亡和存活之間的平衡，在損傷神經(jīng)元的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但清楚認(rèn)識(shí)自噬發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因素及信號(hào)通路，腦缺血時(shí)自噬與凋亡、壞死之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系及作用，以及藥物對(duì)腦缺血的有效治療方法還有待進(jìn)一步研究，更加深入全面地認(rèn)識(shí)自噬與缺血性腦中風(fēng)的關(guān)系，以及相關(guān)的病理及藥理機(jī)制，為腦中風(fēng)的臨床治療提供重要的研究基礎(chǔ)及可行性線索。