耐藥性癲癇與P糖蛋白的研究進(jìn)展

癲癇是以腦部神經(jīng)元異常放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的一種疾病。全球大約有7 000萬(wàn)人罹患癲癇，我國(guó)大約有900萬(wàn)癲癇病人[1-2]。目前，我國(guó)臨床上有近30種抗癲癇西藥，但臨床上約有50%新診斷的病人首次接受藥物治療后，癲癇不能夠得到控制；另有約30%的病人為耐藥性癲癇[3]。2010年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟對(duì)耐藥性癲癇的定義達(dá)成共識(shí)，一是抗癲癇藥物治療的結(jié)局分類：臨床無(wú)發(fā)作、治療失敗及不確定； 二是在治療失敗的基礎(chǔ)上提出了耐藥性癲癇的核心定義：兩種正確選擇、可耐受的抗癲癇藥，經(jīng)足夠療程及劑量治療(單藥或聯(lián)合用藥)后仍未能控制發(fā)作的癲癇[4]。針對(duì)癲癇耐藥性發(fā)病機(jī)制目前存在6種假說(shuō)：多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說(shuō)、基因突變假說(shuō)、藥物靶點(diǎn)假說(shuō)、藥代動(dòng)力學(xué)假說(shuō)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)以及疾病自身嚴(yán)重性假說(shuō)[5]。其中多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說(shuō)于1995年由美國(guó)學(xué)者Tishler提出，認(rèn)為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P糖蛋白(P-gp)參與了抗癲癇藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠通過(guò)水解三磷酸腺苷(ATP)獲取能量，主動(dòng)將抗癲癇藥物逆濃度梯度外排出腦組織，降低腦組織中藥物濃度，而引起癲癇多藥耐藥[6]。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說(shuō)的提出引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注與研究。理論上P-gp介導(dǎo)耐藥性癲癇假說(shuō)的成立應(yīng)當(dāng)滿足以下3個(gè)前提：第一，癲癇耐藥病人血腦屏障中P-gp高表達(dá)；第二，抗癲癇藥物為P-gp作用底物；第三，癲癇耐藥病人腦組織中抗癲癇藥物濃度較藥物敏感性癲癇病人低。本研究就這3個(gè)方面進(jìn)行綜述，為P-gp介導(dǎo)耐藥性癲癇的假說(shuō)的成立提供可能的科學(xué)證據(jù)。

1 P-gp概述

P-gp 為ATP 結(jié)合盒超家族蛋白(ATP-binding cassette，ABC)成員，分子量約為170 KD。1976年Juliano 和 Ling在秋水仙堿耐藥的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)P-gp。人體中P-gp主要由位于人類第7號(hào)染色體 q21.1的多藥耐藥基因1和2(multi-drug resistance gene，MDR)編碼[7]，而嚙齒類動(dòng)物則有mdr1a、mdr1b和mdr2 3個(gè)基因可編碼 P-gp[8]。其中人體中的MDR1與嚙齒類動(dòng)物的mdr1a、mdr1b功能相同，編碼P-gp參與多藥耐藥。而MDR2與mdr2則主要表達(dá)膽小管膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8-9]。P-gp主要表達(dá)于腸道、肝臟、腎臟、血腦屏障以及血胎盤屏障等各類屏障與代謝器官中[10-11]。在正常的腦組織中，P-gp主要表達(dá)于血腦屏障腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與血腦脊液屏障脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中[12]。生理狀態(tài)下 P-gp 起到阻止外源性毒素入侵，排出內(nèi)源性有毒物質(zhì)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，是人體中重要的防御機(jī)制[13-14]。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種P-gp的作用底物，這些底物廣泛分布于天然藥物、化學(xué)藥物、類固醇、熒光染料、環(huán)肽以及離子載體中；主要是疏水性和兩親性，多為雜環(huán)化合物。一般而言，脂溶性越強(qiáng)的藥物越容易進(jìn)入腦組織中。臨床上大部分抗癲癇藥物都為脂溶性的，但是仍有1/3的癲癇病人對(duì)抗癲癇藥物不耐受[3]。其中可能的原因是癲癇病人血腦屏障中過(guò)表達(dá)的P-gp將脂溶性的抗癲癇藥物逆濃度梯度排出腦外，降低了腦組織中癲癇藥物的濃度[6]。

2 耐藥性癲癇P-gp高表達(dá)

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 電刺激建立癲癇持續(xù)狀態(tài)后顳葉癲癇模型因較易出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作而被學(xué)者們廣泛使用。在該模型建立急性與慢性期皆存在P-gp的高表達(dá)。建立模型7 d后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織中出現(xiàn)mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表達(dá)，同時(shí)慢性期大鼠腹側(cè)顳葉神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、顳葉海馬以及海馬旁回中也存在不可逆的mdr1b mRNA與 P-gp的過(guò)表達(dá)，并且其表達(dá)量與癲癇發(fā)作次數(shù)呈正相關(guān)[15-16]。此外，在氯化鋰-匹羅卡品點(diǎn)燃的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中，大鼠腦組織中可檢測(cè)到P-gp的高表達(dá)[17-18]。此外，腹腔注射亞劑量戊四氮反復(fù)點(diǎn)燃的癲癇大鼠模型海馬與皮層中亦能檢測(cè)到高表達(dá)的mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp[19-21]。Lazarowski等[22]反復(fù)給wistar大鼠腹腔注射3-巰基丙酸誘發(fā)癲癇后，大鼠血腦屏障中P-gp的表達(dá)呈進(jìn)行性增加；另外，給3-巰基丙酸誘發(fā)的癲癇模型大鼠腹腔注射苯妥英鈉后，與正常大鼠相比其海馬中苯妥英鈉濃度明顯下降，并且P-gp抑制劑尼莫地平能夠扭轉(zhuǎn)這種下降。最近，3-巰基丙酸誘發(fā)的癲癇模型被選定為抗癲癇藥物臨床前實(shí)驗(yàn)的新模型。經(jīng)3-巰基丙酸持續(xù)誘發(fā)23次癲癇后，100%的動(dòng)物對(duì)苯妥英鈉耐藥，80%的動(dòng)物對(duì)苯巴比妥耐藥[23]。給癲癇小鼠模型腹腔注射苯妥英鈉(30 mg/kg)或卡馬西平(15 mg/kg)，每天2次，干預(yù)7 d后，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-gp顯著升高[24-25]。每天給大鼠腹腔注射苯巴比妥(30 mg/kg)或苯妥英鈉(30 mg/kg，首劑75 mg/kg)，干預(yù)11 d后，各腦區(qū)(額葉皮層、頂葉皮層、杏仁核、海馬、齒狀回、梨狀皮質(zhì)，黑質(zhì)網(wǎng)狀部和小腦)均未出現(xiàn)P-gp的高表達(dá)[26]。相反，馬桑內(nèi)酯引起的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型每天經(jīng)125 mg/kg卡馬西平或187.5 mg/kg丙戊酸鈉灌胃后，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、海馬、顳葉大腦、額葉大腦以及頂葉大腦中均出現(xiàn)P-gp高表達(dá)；而給予100 mg/kg托吡酯或125 mg/kg拉莫三嗪干預(yù)后并未影響P-gp的表達(dá)[27-29]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，反復(fù)進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)、電刺激以及長(zhǎng)時(shí)間使用一些抗癲癇藥物能夠誘導(dǎo)癲癇大鼠、小鼠模型腦組織中mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表達(dá)。

2.2 臨床實(shí)驗(yàn) 1995年，美國(guó)學(xué)者Thishller 對(duì)19例難治性局灶性癲癇病人腦組織進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有11例病人癲癇病灶組織中MDR1 mRNA表達(dá)水平比自身正常腦組織高10倍；14例病人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中出現(xiàn)P-gp的過(guò)表達(dá)[6]。Liu等[30]使用免疫熒光技術(shù)對(duì)癲癇致病灶、硬化海馬以及正常的腦區(qū)中P-gp的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)硬化海馬中P-gp陽(yáng)性顆粒明顯增多。Lazarowski等[31]對(duì)1例對(duì)苯妥英鈉、苯巴比妥以及勞拉西泮耐藥的癲癇病人手術(shù)切除的致癇灶進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了P-gp的高表達(dá)。在難治性癲癇病人顳葉內(nèi)皮細(xì)胞中亦能檢測(cè)到過(guò)表達(dá)的P-gp。Rambeck與他的同事使用圓形微透析探頭對(duì)難治性癲癇切除術(shù)中的病人癲癇灶組織細(xì)胞外液、腦脊液以及血漿中的抗癲癇藥物濃度進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)癲癇灶組織中的抗癲癇藥物濃度明顯比腦脊液中低。這也是首例報(bào)道癲癇致病灶抗癲癇濃度的降低關(guān)系著耐藥性癲癇的產(chǎn)生[32]。Summers等[33]對(duì)1例難治性癲癇病人常規(guī)用藥中添加了P-gp抑制劑維拉帕米后，該病人癲癇控制情況以及生活質(zhì)量明顯改善。臨床實(shí)驗(yàn)表明，耐藥性癲癇病人癲癇病灶與正常腦組織相比，MDR1與P-gp存在高表達(dá)，并且癲癇灶組織中的抗癲癇藥物濃度明顯降低；這可能提示某些抗癲癇藥物為P-gp的作用底物。

以上動(dòng)物與臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測(cè)出以下兩點(diǎn)：第一，癲癇的反復(fù)發(fā)作以及長(zhǎng)時(shí)間服用抗癲癇藥物均能夠引起P-gp高表達(dá)；第二，一些耐藥性癲癇病人腦組織中確實(shí)存在高表達(dá)的P-gp。然而既往臨床實(shí)驗(yàn)皆缺乏健康對(duì)照組和藥物耐受性對(duì)照組，相關(guān)結(jié)論需要進(jìn)一步證實(shí)。此外，在P-gp高表達(dá)的前提條件成立的情況下，高表達(dá)的P-gp能夠作用于抗癲癇藥物，對(duì)于P-gp介導(dǎo)耐藥性癲癇假說(shuō)的成立則尤為重要。

3 P-gp與抗癲癇藥物

P-gp能夠主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)疏水性和兩親性化合物，而大部分抗癲癇過(guò)程依靠平面親脂性分子，所以理論上很多種抗癲癇藥物都應(yīng)該為P-gp的底物。第1個(gè)關(guān)于P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)抗癲癇藥物的實(shí)驗(yàn)是由Tishler完成的。他發(fā)現(xiàn)與正常的神經(jīng)外胚層細(xì)胞相比，MDR1高表達(dá)的神經(jīng)外胚層細(xì)胞中苯妥英鈉含量顯著降低[6]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在癲癇持續(xù)狀態(tài)引起的P-gp高表達(dá)的大鼠和mdr1a/b基因敲除的小鼠體內(nèi)得到證實(shí)[24，34-35]。在大鼠腦組織微量透析實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)微透析探針給予P-gp抑制劑維拉帕米的干預(yù)后，顯著地增加了大腦皮層細(xì)胞外液中苯巴比妥、拉莫三嗪、非爾氨酯以及奧卡西平的含量。相反，在mdr1a基因敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)研究中，僅發(fā)現(xiàn)P-gp能夠作用于托吡酯，而對(duì)苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、氨己烯酸、拉莫三嗪以及加巴噴丁無(wú)作用[36]。

關(guān)于P-gp作用于卡馬西平的實(shí)驗(yàn)研究得到了不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[37]。據(jù)Mdr1a/b基因敲除的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外Caco-2以及人體淋巴細(xì)胞羅丹明123集聚實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Owen 等[38]認(rèn)為卡馬西平不是P-gp的作用底物。而在大鼠腦組織微量透析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，P-gp抑制劑維拉帕米干預(yù)后顯著地增加了大腦皮層細(xì)胞外液中卡馬西平的濃度。另1項(xiàng)使用mdr1a/b基因敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)研究亦得到相似的結(jié)論[39]。在單層細(xì)胞外排實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了人和小鼠編碼P-gp cDNAs的豬與狗腎臟細(xì)胞并不能夠轉(zhuǎn)運(yùn)丙戊酸鈉[40]。Baltes等[41]使用相同的細(xì)胞模型進(jìn)行了雙向傳輸實(shí)驗(yàn)，表明苯妥英鈉和拉莫三嗪只能夠被小鼠編碼的P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究指出由于大部分抗癲癇的藥物為高滲透性，抗癲癇藥物的主動(dòng)擴(kuò)散作用可影響P-gp作用于抗癲癇藥物的結(jié)果，傳統(tǒng)的雙向傳輸實(shí)驗(yàn)并不是研究P-gp與抗癲癇藥物相互關(guān)系的理想模型。因此，他們使用了一種改良的實(shí)驗(yàn)方法，即濃度平衡運(yùn)輸法。濃度平衡運(yùn)輸法是指實(shí)驗(yàn)開始即在細(xì)胞兩側(cè)加上等濃度的抗癲癇藥物，以消除抗癲癇藥物主動(dòng)擴(kuò)散作用對(duì)P-gp功能的影響。濃度平衡運(yùn)輸法檢測(cè)出苯妥英鈉、苯巴比妥、拉莫三嗪以及托吡酯均能夠被人體編碼的P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)[42]。Zhang等[43]利用雙向傳輸實(shí)驗(yàn)和濃度平衡運(yùn)輸法證實(shí)了以上結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)乙琥胺亦是P-gp的作用底物。Verbeek等[44-45]在大鼠體內(nèi)使用PET示蹤技術(shù)研究了苯妥英鈉與P-gp相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)P-gp對(duì)苯妥英鈉有微弱的轉(zhuǎn)運(yùn)作用；在同樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)里，結(jié)果顯示p-gp并不作用于苯巴比妥。目前有關(guān)P-gp與抗癲癇藥物的臨床實(shí)驗(yàn)尚缺乏。Marchi等[46]對(duì)11例術(shù)中的難治性癲癇病人利用液相與紫外技術(shù)檢測(cè)了其腦組織與血漿中奧卡西平代謝產(chǎn)物10-OHCBZ的濃度；并且使用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)了致癇灶組織中MDR1 mRNA的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)腦組織與血漿中10-OHCBZ的濃度比值與致癇灶組織中MDR1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，隨后進(jìn)一步顯示了P-gp抑制劑XR9576的干預(yù)能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)10-OHCBZ的吸收。

關(guān)于P-gp與抗癲癇藥物的相互關(guān)系，不同的模型可能得到不同的結(jié)果，甚至相反的結(jié)論。2012年，Zhang等[47]總結(jié)了拉莫三嗪、奧卡西平、卡馬西平、苯巴比妥以及苯妥英鈉是P-gp作用底物，且與P-gp的相互作用關(guān)系在體內(nèi)外多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中獲得證實(shí)。

4 小 結(jié)

針對(duì)癲癇耐藥性發(fā)病機(jī)制存在多種假說(shuō)，其中最受關(guān)注的為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為，多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp參與了抗癲癇藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠通過(guò)水解ATP 獲取能量將藥物逆濃度梯度外排出腦組織，降低腦組織中抗癲癇藥物的濃度，而引起癲癇多藥耐藥。為了論證該假說(shuō)的成立，學(xué)者們進(jìn)行了大量的臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，主要的發(fā)現(xiàn)有：①癲癇耐藥病人與耐藥動(dòng)物模型血腦屏障中存在P-gp高表達(dá) ；②一些抗癲癇藥物為P-gp作用底物，如拉莫三嗪、奧卡西平、卡馬西平、苯巴比妥以及苯妥英鈉等；③癲癇耐藥病人腦組織中抗癲癇藥物濃度較藥物敏感性癲癇病人低。當(dāng)然，有些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)亦存在不足之處。如臨床實(shí)驗(yàn)缺乏正常腦組織的對(duì)照；Mdr1a/b基因敲除的動(dòng)物中其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的代償性表達(dá)而出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性；細(xì)胞模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一等；這些因素皆影響著該假說(shuō)的成立，相關(guān)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該更進(jìn)一步的完善補(bǔ)充。有關(guān)耐藥性癲癇與P糖蛋白的研究有利于發(fā)現(xiàn)新的治療癲癇以及預(yù)防和扭轉(zhuǎn)癲癇耐藥性的方法，值得更深入的研究。