血管平滑肌細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞miRNA
——中醫(yī)藥干預(yù)PCI預(yù)后的新靶點(diǎn)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)擴(kuò)大了冠心病(coronary artery disease，CAD)治療領(lǐng)域，但在不斷解決問(wèn)題的同時(shí)也帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。最初的單純球囊血管成形術(shù)因冠狀動(dòng)脈的彈性回縮而具有較高的再次介入率[1]。金屬裸支架(bare-metal stents，BMS)植入后血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)異常增殖和遷移引起新生內(nèi)膜過(guò)度增生[2]，由此導(dǎo)致較高概率的支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)及1年內(nèi)再次血運(yùn)重建[3]。藥物洗脫支架(drug-eluting stents，DES)能夠釋放抗增殖藥物，抑制細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜增生，預(yù)防再狹窄，降低PCI術(shù)后靶病變血運(yùn)重建率[4-5]，然而，又帶來(lái)了晚期支架內(nèi)血栓等問(wèn)題[6]。這主要與支架上抗增殖藥物的非選擇性作用有關(guān)，其在高效抑制VSMCs增殖和遷移的同時(shí)也具有抑制血管再內(nèi)皮化等相關(guān)副作用[7]。PCI術(shù)后血管損傷修復(fù)是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，諸多細(xì)胞參與其中，尤其是VSMCs和內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)扮演著重要角色[8]。人類所有的基因中只有約2%負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，而那些從所謂的“非編碼”基因組區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。miRNA是ncRNA中重要的一種，大量研究表明，其能夠調(diào)控包括參與血管重塑的基因在內(nèi)的大量基因的表達(dá)[9]。中醫(yī)藥具有多器官、多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，而miRNA調(diào)控機(jī)體病理生理過(guò)程同樣具有多種機(jī)制，通過(guò)中醫(yī)藥調(diào)控miRNA水平具有巨大的治療潛力。本研究綜述VSMCs及ECs中miRNA在血管重塑過(guò)程中的分子機(jī)制中的作用以及中醫(yī)藥對(duì)其干預(yù)作用。

1 VSMCs miRNA概述

成年動(dòng)物中VSMCs主要表現(xiàn)為收縮和合成兩種表型，在各種刺激下會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)換，具有巨大的可塑性。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)控了VSMCs的表型轉(zhuǎn)換，其功能失調(diào)與PCI術(shù)后ISR等多種血管阻塞性疾病有關(guān)[10]。在血管重塑期間，VSMCs從收縮表型轉(zhuǎn)換到合成表型，大量的VSMCs在內(nèi)膜中積累，并向中心積聚[11]。目前相關(guān)研究已證實(shí)了幾種miRNA在VSMCs表型轉(zhuǎn)換中的調(diào)控作用。

1.1 抑制VSMCs增殖的miRNA miRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，許多miRNA已經(jīng)被證實(shí)參與調(diào)控多種疾病相關(guān)基因的表達(dá)。其中，miR-143和miR-145是血管發(fā)育和血管疾病中VSMCs表型轉(zhuǎn)換的主要調(diào)節(jié)因子[12]。Elia等[13]研究表明，miR-145和miR-143基因簇會(huì)導(dǎo)致小鼠VSMCs不完全分化，在模型小鼠增殖的VSMCs中水平明顯較低。其他研究也表明，過(guò)表達(dá)miR-145抑制了大鼠受損頸動(dòng)脈中的VSMCs增殖和新生內(nèi)膜形成[14]。多項(xiàng)研究均表明，miR-145/miR-143簇通過(guò)對(duì)多種靶基因的調(diào)控維持VSMCs的收縮表型。如miR-145通過(guò)抑制Kruppel樣因子5(Kruppel-like factor 5，KLF-5)調(diào)節(jié)VSMCs分化標(biāo)志物，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移顯著減少[14]。Quintavalle等[15]發(fā)現(xiàn)miR-145和miR-143直接以PKC-ε、PDGF受體α(PDGF-Rα)和肌成束蛋白(Fascin)為靶標(biāo)控制VSMCs小體形成。Cordes等[12]報(bào)道Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，KLF-4)和ELK-1(ETS癌基因家族成員)也分別是miR-145和miR-143的靶基因。此外，血液中miR-143的水平能夠預(yù)測(cè)外周動(dòng)脈閉塞性疾病或CAD病人的支架內(nèi)再狹窄[16-17]，這些臨床證據(jù)進(jìn)一步證明miR-143/miR-145簇是新生內(nèi)膜形成的分子機(jī)制中的重要一環(huán)。

除miR-145和miR-143外，miR-22也在VSMCs分化中起關(guān)鍵作用。在最近的一項(xiàng)研究中，Yang等[18]表明miR-22在受損的股動(dòng)脈中水平下調(diào)，其主要靶向調(diào)控甲基CpG結(jié)合蛋白2(MECP2)、組蛋白去乙?；?(HDAC4)和親嗜性病毒整合位點(diǎn)1蛋白同源物(EVI1)的3'UTR區(qū)；通過(guò)功能獲得或功能喪失體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明過(guò)表達(dá)miR-22抑制了VSMCs增殖以及損傷股動(dòng)脈中的新生內(nèi)膜形成，低表達(dá)則得到了相反的結(jié)果。

Torella等[10]在球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈中觀察到miR-133水平較對(duì)照組明顯降低。腺病毒介導(dǎo)的miR-133過(guò)表達(dá)減少了球囊損傷后的新生內(nèi)膜形成，低表達(dá)結(jié)果也從反面加以證實(shí)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-133主要通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Sp-1和Moesin，抑制VSMCs的增殖和遷移。臨床研究也表明介入術(shù)后低miR-133a濃度水平預(yù)示了更高的ISR靶病變血運(yùn)重建率[19]。

調(diào)節(jié)VSMCs生理功能和血管再狹窄的其他重要miRNA還包括miR-195。研究表明miR-195通過(guò)靶向調(diào)控Cdc42、細(xì)胞周期蛋白D1和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(fibroblast growth factor 1，F(xiàn)GF1)抑制VSMCs的增殖、遷移和促炎生物標(biāo)志物的表達(dá)，而氧化低密度脂蛋白(oxLDL)能夠降低miR-195水平[20]。此外，miR-195過(guò)表達(dá)能夠抑制大鼠頸動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增厚[20]。外周動(dòng)脈疾病病人行支架植入術(shù)后，循環(huán)miR-195水平被證明是其2年后靶血管血運(yùn)重建的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[21]。

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，其他miRNA參與調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換。miR-23b通過(guò)直接調(diào)節(jié)尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，SMAD家族成員3(SMAD3)和FoxO4來(lái)抑制VSMCs的增殖和遷移，過(guò)表達(dá)miR-23b可顯著降低損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成[22]。miR-125a-5p水平在增殖的VSMCs中較低，其負(fù)向調(diào)節(jié)血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)介導(dǎo)細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)[23]。據(jù)報(bào)道，miR-663通過(guò)靶向調(diào)控JunB和肌球蛋白輕鏈9(MLC9)負(fù)調(diào)節(jié)VSMCs的遷移及其分化標(biāo)記基因在人體中的表達(dá)。此外，miR-663的過(guò)表達(dá)減少了小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎引起的血管損傷后新生內(nèi)膜病變的形成[24]。

1.2 促進(jìn)VSMCs增殖的miRNA Ji等[25]實(shí)驗(yàn)表明,miR-21通過(guò)直接靶向調(diào)控VSMCs的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子磷酸酶與張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)促進(jìn)VSMCs增殖，進(jìn)一步研究表明，向受損動(dòng)脈遞送抗miR-21的反義寡核苷酸可以抑制大鼠的新生內(nèi)膜形成。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建ISR模型，最終結(jié)果也都證明了miR-21在調(diào)節(jié)血管對(duì)損傷反應(yīng)中的重要性。McDonald等[26]研究表明miR-21基因消融減少了小鼠血管支架植入后血管炎癥和重塑。Wang等[27]使用抗miR-21涂層支架測(cè)試了局部遞送miR-21抑制劑對(duì)損傷動(dòng)脈的影響，結(jié)果表明這種方法能夠顯著降低ISR而不影響再內(nèi)皮化。He等[17]報(bào)道，經(jīng)過(guò)血管造影結(jié)果判定的再狹窄病人與對(duì)照組相比，miR-21循環(huán)水平明顯升高，證明miR-21在人體中也起到重要的調(diào)節(jié)作用。

血管再狹窄中上調(diào)的miRNA還包括miR-221和miR-222[28]。這兩種miRNA都能夠促進(jìn)VSMCs的增殖，其作用部分是通過(guò)抑制靶基因p27(Kip1)和p57(Kip2)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。敲低miR-221和miR-222抑制了大鼠血管成形術(shù)后頸動(dòng)脈的新生內(nèi)膜增生[28]。最近還有研究報(bào)道，糖尿病小鼠動(dòng)脈和VSMCs中miR-221和miR-222的水平增加，抑制這兩種miRNA能阻止糖尿病動(dòng)脈損傷后VSMCs異常增殖[29]。

miR-31的表達(dá)水平在損傷的大鼠頸動(dòng)脈中顯著增加[30]。大型腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2，LATS2)通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而miR-31通過(guò)下調(diào)LATS2促進(jìn)VSMCs增殖[30]。此外，miR-31通過(guò)下調(diào)E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)水平，促進(jìn)人VSMCs轉(zhuǎn)向合成表型[31]。有研究表明，miR-146a通過(guò)靶向KLF4正調(diào)節(jié)VSMCs的合成表型，過(guò)表達(dá)miR-146a增加VSMCs增殖，而抑制其在受損大鼠頸動(dòng)脈中的表達(dá)能減少新生內(nèi)膜增生[32]。Sun等[33]評(píng)估了miR-206在VSMCs表型轉(zhuǎn)換中的作用，研究表明其在受損血管壁的增殖性VSMCs中的表達(dá)顯著增加；相反，慢病毒介導(dǎo)的miR-206抑制減少了球囊損傷后的新生內(nèi)膜形成。miR-181b通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移，抑制內(nèi)源性miR-181b水平能夠抑制血管成形術(shù)后大鼠頸動(dòng)脈的新生內(nèi)膜增生[34]。

2 ECs miRNA概述

內(nèi)皮功能對(duì)維持血管生理機(jī)能和改善支架植入術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后至關(guān)重要。PCI術(shù)植入支架后會(huì)導(dǎo)致血液剪切應(yīng)力改變，而ECs能調(diào)節(jié)血管對(duì)剪切應(yīng)力變化的反應(yīng)，并且支架術(shù)后腔內(nèi)單層ECs的快速再生對(duì)于預(yù)防再狹窄和支架內(nèi)血栓具有重要意義[35]。ECs中表達(dá)最高的miRNA是miR-126，其在炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙中扮演了重要角色，缺失會(huì)影響受損動(dòng)脈中的ECs再生，并導(dǎo)致小鼠血管完整性喪失和血管新生減少[36]。miR-126通過(guò)抑制蛋白SPRED-1和PIK3R激酶以及炎性細(xì)胞因子血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)調(diào)節(jié)ECs中兩種主要信號(hào)通路-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)通路和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路[36]。miR-126也調(diào)節(jié)ECs對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)，并通過(guò)調(diào)節(jié)ECs周轉(zhuǎn)來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用[37]。此外，其通過(guò)調(diào)控活化的白細(xì)胞黏附分子(ALCAM)和SetD5來(lái)阻止白細(xì)胞的黏附，減少單核細(xì)胞向被ox-LDL損傷的ECs聚集，以此抑制PI3K/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路的激活[38-39]。盡管其生物學(xué)功能尚未完全闡明，但低水平的miR-126與急性心肌梗死、心力衰竭以及CAD等多種心血管疾病有關(guān)[40]。

miR-17/92a簇是CAD中的另一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，無(wú)論是在缺血和血管損傷的大鼠、小鼠模型中，還是在冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)后處于運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期間的病人中都能看到其水平上調(diào)[41]。miR-92a具有負(fù)向調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的功能；抑制其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致ECs增殖和遷移增加，并促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)[42]。相關(guān)研究表明，其通過(guò)調(diào)控整合素-A5(integrin-A5，ITGA5)減少血管成形術(shù)模型大鼠的再狹窄[41]。在股動(dòng)脈損傷模型小鼠中，抑制miR-92a能加速損傷血管再內(nèi)皮化，預(yù)防新生內(nèi)膜過(guò)度增生，這與其被抑制導(dǎo)致的ITGA5和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)表達(dá)水平增加有關(guān)[43]。miR-92a在動(dòng)脈粥樣硬化易感區(qū)域分離的ECs中的表達(dá)更高，可能是由于其通過(guò)微調(diào)KLF-2和KLF-4發(fā)揮部分促動(dòng)脈粥樣硬化作用[44]。同時(shí)，miR-92a還有調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的作用，eNOS負(fù)責(zé)產(chǎn)生的NO具有抗動(dòng)脈粥樣硬化特性，進(jìn)一步證實(shí)了其在該過(guò)程中的關(guān)鍵作用[45]。

miR-221/222也是參與調(diào)節(jié)ECs產(chǎn)生NO的重要miRNA之一[46]，其在ECs和VSMCs中發(fā)揮著明顯不同的特異性調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)ECs的作用主要是抑制增殖和遷移，這種機(jī)制在血管病理生理中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[47]。有研究表明，miR-222參與了細(xì)胞間交流，其通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)的表達(dá)[48]。最近的臨床研究觀察到阿托伐他汀能下調(diào)CAD病人內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-221/222的表達(dá)，并且與低密度脂蛋白(LDL)水平正相關(guān)，表明其參與了他汀類藥物降脂機(jī)制[49]。另外，miR-221/222還通過(guò)多種途徑參與了ECs凋亡、促動(dòng)脈粥樣硬化以及血管新生等病理過(guò)程的調(diào)控[50]。

miR-21在發(fā)育、炎癥和心血管疾病等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[51]。在ECs中，miR-21通過(guò)靶向調(diào)控PTEN、SMAD7、Ⅰ型和Ⅴ型膠原以及蛋白多糖的表達(dá)調(diào)控血管新生[52]。此外，miR-21的表達(dá)受到單向和振蕩剪切力的調(diào)節(jié)，并根據(jù)具體刺激的不同，其作用可表現(xiàn)為促進(jìn)eNOS磷酸化、NO產(chǎn)生或者抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)表達(dá)[53-54]。最近，有研究小組的結(jié)果表明高水平的miR-16通過(guò)抑制RhoGDIα并降低NO生物利用度，造成后肢缺血模型小鼠內(nèi)皮修復(fù)不良，甚至加重血管損傷反應(yīng)[55]。miR-16通過(guò)調(diào)控VEGF、VEGF受體-2(VEGFR2)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(FGFR1)來(lái)抑制體外ECs的增殖和遷移，同時(shí)還會(huì)損害體循環(huán)中促血管新生細(xì)胞的功能[56]。因miR-16水平與再狹窄風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，許多研究者也將其視為肢體血管嚴(yán)重狹窄病人預(yù)后的可能生物標(biāo)志物[57]。

3 中醫(yī)藥對(duì)VSMCs、ECs中miRNA的干預(yù)作用

miRNA主要參與調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞分化、凋亡、增殖等諸多生物學(xué)過(guò)程。在植物中普遍存在miRNA，中藥來(lái)源的miRNA可以通過(guò)日常攝食的方式進(jìn)入人體血液和組織器官，調(diào)控人體靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響人體生理功能，中藥中miRNA可能是中藥作用的有效成分和物質(zhì)基礎(chǔ)[58]。中醫(yī)藥能通過(guò)調(diào)控miRNA水平特異性調(diào)控ECs和VSMCs的增殖分化。有研究表明，黃芪甲苷可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)，進(jìn)而影響Akt相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管新生[59]。丹皮酚能夠減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管ECs氧化應(yīng)激損傷，其主要機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)miR-21的表達(dá)水平來(lái)提高PTEN的表達(dá)，從而抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路的磷酸化；上調(diào)損傷的miRNA-126水平，從而抑制PI3K/Akt/NF-κB通路，減少VCAM-1的釋放，阻止單核細(xì)胞向ECs黏附[60-61]。結(jié)扎SD大鼠前降支構(gòu)建心肌梗死模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽可升高心肌梗死邊緣區(qū)miRNA-126表達(dá)水平，促進(jìn)血管新生[62]。將當(dāng)歸補(bǔ)血湯的有效成分制成控釋微囊，結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血微囊可增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的活力，促進(jìn)其增殖，并上調(diào)miR-21的表達(dá)水平，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)血管新生[63]。白藜蘆醇(resveratrol)是虎杖等中藥材的活性成分，有研究顯示其可通過(guò)抑制miR-138的表達(dá)來(lái)抑制在db/db小鼠VSMCs中被高糖所誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)的上調(diào)，從而抑制db/db小鼠VSMCs的增殖和移行[64]。通心絡(luò)在體內(nèi)和體外均能抑制VSMCs的增殖和遷移，并能逆轉(zhuǎn)miR-29a對(duì)VSMCs的促增殖和遷移作用[65]。

4 小 結(jié)

miRNA作為一種重要的ncRNA在VSMCs和ECs中均有較高的存在水平，主要通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來(lái)調(diào)控兩種細(xì)胞的增殖和遷移等活動(dòng)。PCI術(shù)后的損傷修復(fù)過(guò)程極其復(fù)雜，也是減少ISR以及改善病人預(yù)后的重點(diǎn)關(guān)注環(huán)節(jié)，而VSMCs和ECs是其中的關(guān)鍵因素。雖然介入技術(shù)不斷發(fā)展，手術(shù)器械日新月異，但目前仍沒(méi)有有效手段去解決促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖修復(fù)與抑制平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生之間的矛盾。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間通過(guò)外泌體交流，而外泌體中發(fā)揮重要作用的是miRNA。同時(shí)部分miRNA在VSMCs和ECs中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，這就為探究PCI術(shù)后損傷修復(fù)問(wèn)題提供了一個(gè)新的研究思路—靶向調(diào)控某一種或某幾種miRNA的表達(dá)水平，在促進(jìn)EC增殖遷移以加快內(nèi)皮修復(fù)的同時(shí)抑制VSMCs過(guò)度增殖，減少再狹窄[66]。另外，中醫(yī)藥是我國(guó)傳統(tǒng)文化的瑰寶，既往的臨床研究已表明其在干預(yù)PCI術(shù)后并發(fā)癥等方面具有積極的作用，實(shí)驗(yàn)研究也證明了其對(duì)VSMCs和ECs的調(diào)控作用[67]。中醫(yī)藥可能通過(guò)多靶點(diǎn)、雙向調(diào)節(jié)miRNA水平來(lái)發(fā)揮其特異性調(diào)控VSMCs和ECs的功能。目前，已有部分研究表明中醫(yī)藥能夠調(diào)節(jié)miRNA水平，仍需要更多的臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)去探討中醫(yī)藥對(duì)miRNA的調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)中醫(yī)藥在干預(yù)PCI術(shù)后并發(fā)癥等方面發(fā)揮更大作用。