新方法：聆聽腦電交響樂

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2010年，生物物理學(xué)家亞當(dāng)·科恩（Adam Cohen）漫步于加利福尼亞舊金山時，接到一個意料之外的電話：“我們捕捉到信號了！”電話的另一端在5 000公里之外的馬薩諸塞州坎布里奇，是他的合作者一鏟挖到了寶藏。在實(shí)驗(yàn)失敗了幾個月后，研究者終于發(fā)現(xiàn)了一種熒光蛋白，可以反映信號在神經(jīng)元間的傳遞。

但出了件怪事。當(dāng)科恩回到哈佛大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室，他發(fā)現(xiàn)所有實(shí)驗(yàn)中的記錄都呈現(xiàn)出一種奇怪的趨勢。最初，蛋白修飾的神經(jīng)元都在電沖動一閃而過時發(fā)出閃光。但接著，細(xì)胞就持續(xù)發(fā)光，形成了明亮的斑點(diǎn)?！懊看斡涗浀揭话霑r，信號就像發(fā)了狂一樣?！笨贫髡f。

因此他決定和他的團(tuán)隊一起進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)?！爱?dāng)記錄開始時，他們緊張地屏住呼吸，”科恩說，“接著實(shí)驗(yàn)成功了，他們開始慶祝，繞著屋子邊跑邊跳?！?/p>

在他們興奮地慶祝時，桌上的臺燈正巧照到了顯微鏡上?！拔覀兤鋵?shí)記錄下了我們的興奮?！碑?dāng)時科恩團(tuán)隊中的一個研究生丹尼爾·霍克巴姆（Daniel Hochbaum）說。歡呼聲漸漸平息，一年后，科恩的團(tuán)隊發(fā)表了研究成果——修飾哺乳動物特定神經(jīng)元的熒光蛋白能夠用于實(shí)時記錄單個神經(jīng)元的電沖動。他們是最先發(fā)表這一成果的研究團(tuán)隊之一。

神經(jīng)科學(xué)家多年來一直在嘗試記錄轉(zhuǎn)瞬即逝的神經(jīng)元電信號——腦活動的主要內(nèi)容。盡管電極作為可靠的電壓測量手段能測定單個神經(jīng)元的活動，卻很難在神經(jīng)元數(shù)量和記錄時間上有所突破。過去的20年中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了向神經(jīng)元細(xì)胞膜上植入可指示電壓的熒光蛋白的方法。在特定的顯微鏡下，細(xì)胞便顯露出它們間的對話來，或是一絲低語，或是一聲呼喊。電壓圖像還能夠同時記錄一大片神經(jīng)元間的“對話”，并以某一區(qū)域的腦組織作為單位將信號進(jìn)行平均化計算。這可以幫助研究者以空間尺度研究大腦的電活動，僅僅聆聽一個神經(jīng)元的聲音無疑無法做到這一點(diǎn)，我們需要記錄的是科恩比喻的“眾人的喧鬧聲”。

過去5年中，科學(xué)家發(fā)表了大約1 000篇這一主題的論文。同時，幾個大型的資助計劃，像美國國立衛(wèi)生研究院的“腦計劃（BRAIN initiative）”，加速了一些新型基因工程電壓指示器的發(fā)展。為了找到更好的方法，一些課題組甚至提出對數(shù)百萬的蛋白進(jìn)行篩選的策略，希望以此來找到具有一定特性，比如具有一定亮度的發(fā)光蛋白。其中一個課題組成功地鑒定出一種指示蛋白，相比4年前研發(fā)的類似指示系統(tǒng)，具有兩倍的亮度。

這些蛋白不斷進(jìn)步的同時，顯微鏡技術(shù)的發(fā)展也使人們得到更清楚的圖像，科學(xué)家希望以此解決神經(jīng)科學(xué)最大的謎團(tuán)：腦中的細(xì)胞是如何共同運(yùn)作將電信號轉(zhuǎn)換為思想、行動和情感的。研究者仍然希望可以捕捉到全范圍的腦活動，并試著設(shè)計出新方法來觀察腦組織內(nèi)快而深的神經(jīng)沖動。如果這些技術(shù)難題被攻克，紐約市哥倫比亞大學(xué)研究神經(jīng)環(huán)路功能的拉斐爾·尤斯特（Rafael Yuste）指出：“這將是革命性的?！?/p>

多種多樣的熒光

科學(xué)家如今已經(jīng)建立了一些不同類型的基因編碼電壓指示器（GEVIs）。其中主要的一種（上）將電壓感受蛋白，譬如鈉離子通道的膜結(jié)合部位，與一個或多個熒光視紫紅質(zhì)相融合，一個膜通道將直接改變其對電場反應(yīng)的熒光特質(zhì)。

電壓感受融合蛋白

基于視蛋白的電壓指示器

膜上的電位變化使GEVI改變形狀，降低附著蛋白的熒光

膜上的電位變化可以使視黃醛——視蛋白中的“光敏元件”結(jié)合一個質(zhì)子，改變其熒光

高速進(jìn)程

人腦平均約含1 200億個神經(jīng)元，它們無時無刻不在運(yùn)作著，通過樹突等樹枝狀突起接收和發(fā)出信息。到達(dá)樹突的化學(xué)或電信號使樹突的細(xì)胞膜產(chǎn)生微小的電位變化，并傳至胞體。當(dāng)電位的改變到達(dá)所謂的“閾值”后便不再恢復(fù)，神經(jīng)元膜上將激起一個巨大的峰電位，即動作電位。這一電位將沿著神經(jīng)元突起中的軸突，以每秒150米的速度傳遞至另一組樹枝狀突起。并于此通過化學(xué)或電信號將信息傳遞至周圍其他神經(jīng)元的樹突。

神經(jīng)元信號匯聚、分散并同步化，奏出思想、情感、行為和反應(yīng)的交響曲，從害羞時的面紅耳赤，到新生兒的打嗝。但科學(xué)家聆聽這首樂曲的手段相當(dāng)有限。最初于20世紀(jì)40年代，科學(xué)家用細(xì)如發(fā)絲的微小電極插入腦中，置于神經(jīng)元的表面或內(nèi)部，以此精確而又快速地測量到細(xì)胞膜上的電位。但這一方法的局限在于只能同時測量一個或少數(shù)幾個神經(jīng)元，也只能維持有限的一段時間，畢竟電極終將破壞細(xì)胞。這正像是只給人聽交響樂團(tuán)中的一個演奏者幾秒鐘的演奏，卻讓人從中領(lǐng)會到整首交響樂的編曲精髓所在，只能說是管窺蠡測。

成束的微電極可以同時記錄超過200個細(xì)胞的電活動，但由于這些電極被置于細(xì)胞膜外表面附近，而非細(xì)胞膜內(nèi)，只能檢測到電活動中最劇烈的電位變化——動作電位。它們聽不到那些樂曲中弱音——那些微小而不引起動作電位的電位變化。但這些閾下電位變化卻至關(guān)重要，是它們的逐漸累積確定了神經(jīng)元何時會產(chǎn)生動作電位。

為了在更小的電活動程度和更大的數(shù)量上進(jìn)行測量，20世紀(jì)60年代，科學(xué)家開始設(shè)想是否可以設(shè)計一種感受器或探針，在電信號的作用下能夠發(fā)出熒光。最常用的探針是鈣指示劑，當(dāng)電活動產(chǎn)生峰電位時，鈣離子流入神經(jīng)元，而鈣指示劑在結(jié)合鈣離子后發(fā)光。但鈣離子成像這一技術(shù)僅僅能間接反映細(xì)胞電活動，并不能直接記錄細(xì)胞膜電位。同時，盡管它能記錄動作電位這種較為劇烈的電位變化，仍然對微小的膜電位變化或抑制了動作電位的電信號充耳不聞。這又如同是僅僅聽到交響樂結(jié)束后的掌聲震耳欲聾，顯然演出這一事件發(fā)生了，但演奏內(nèi)容不得而知。

20世紀(jì)70年代，科學(xué)家開始研發(fā)能夠直接檢測細(xì)胞膜電位變化的染料傳感器。最初的染料必須被無差別地涂布于整個腦組織，因此所有種類的細(xì)胞都被標(biāo)記了，那些同樣被標(biāo)記的非神經(jīng)元細(xì)胞，就使解析特定的神經(jīng)元電活動變得很困難。

到了90年代，研究者開始嘗試能夠通過基因工程技術(shù)表達(dá)于特定神經(jīng)元的指示器。第一個基因編碼電壓指示器（genetically encoded voltage indicator，GEVI）于1997年問世，這之后，許多研究者如法炮制，研發(fā)得到了超過20種傳感器。其中有些是通過將電壓敏感蛋白同熒光分子相結(jié)合（見上圖“多種多樣的熒光”）。當(dāng)這些蛋白在檢測到電位變化后，三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)合分子的熒光進(jìn)而發(fā)生變化。另一種傳感器則是微生物視紫紅質(zhì)的突變體，這是一種在光照條件下可使質(zhì)膜電位發(fā)生變化的熒光分子。它也可以反其道而行之，在膜電位變化時，改變其熒光。

細(xì)節(jié)決定成敗

至今為止，GEVIs已成功在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿中的神經(jīng)元細(xì)胞和從昆蟲到小鼠的許多種動物的完整大腦中，記錄了單個動作電位。這一技術(shù)最有前景之處在于它有可能實(shí)現(xiàn)記錄膜電位除了劇烈電位變化之外的、微小的閾下變化，以此反映出神經(jīng)元細(xì)胞從周圍細(xì)胞中接收到的訊息?？贫髡f：“電壓成像讓人們看到體內(nèi)神經(jīng)元的輸入信號，這在以前如同是天方夜譚。”

在過去一年，科恩和他的同事們開發(fā)了新的GEVIs，并改善了顯微鏡技術(shù)，使同時記錄大量神經(jīng)元的閾下電位變化成為可能，并在小鼠腦內(nèi)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。他的團(tuán)隊同時實(shí)現(xiàn)了記錄同一神經(jīng)元最多一周后的電活動?！按_切了解實(shí)驗(yàn)中記錄了哪些神經(jīng)元，并長期跟蹤它們的活動，讓研究者有機(jī)會了解到神經(jīng)元間的連接，”麻省理工學(xué)院的神經(jīng)科學(xué)家艾德·博伊登（Ed Boyden）說，“通過這種方法，就可能將腦的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系起來，這是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的核心問題之一。”

GEVIs的另一個優(yōu)勢在于，它不同于電極主要從細(xì)胞胞體處記錄，而能夠從神經(jīng)細(xì)胞的任意部位記錄電信號，從胞體一直到樹突末端（見下圖“直擊多尺度”）。這如同是能夠直接聽見鋼琴家左手彈奏的音符?！斑@是我多年來的夢想，自然我也絕非一人，”加拿大魁北克省拉瓦爾大學(xué)的神經(jīng)生物學(xué)家凱特琳·托斯（Katalin Toth）說，“許多神經(jīng)科學(xué)家都努力通過追蹤神經(jīng)元整體的電壓變化，來研究電壓在細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)的變化?！?/p>

伊利諾伊州芝加哥大學(xué)的神經(jīng)生物學(xué)家魏巍正使用GEVIs研究不同的電輸入信號是如何在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元內(nèi)被整合的。魏巍的研究興趣涉及一類能夠?qū)σ欢ǚ较蜻\(yùn)動的視覺刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)的神經(jīng)元。通過觀測這些神經(jīng)元不同部位膜電位的變化，她希望可以理解細(xì)胞如何處理輸入信號，以探測刺激的運(yùn)動方向。

巴黎高等師范學(xué)校的神經(jīng)生理學(xué)家文森特·維萊特（Vincent Villette）利用電壓傳感器研究閾下電信號的周期性波動如何影響小鼠小腦神經(jīng)對肌肉活動的協(xié)調(diào)。維萊特表示：有關(guān)細(xì)胞如何協(xié)同運(yùn)作，我們還知之甚少。

直擊多尺度

GEVIs有希望用于多種尺度上的神經(jīng)元成像。GEVIs在組織中可用于同時測量許多神經(jīng)元；亦可用于觀測僅由幾個神經(jīng)元組成的小型細(xì)胞環(huán)路中的信號交換；還可以用于研究單個細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)。現(xiàn)有的其他技術(shù)如鈣離子成像和電極如今都不能實(shí)現(xiàn)這種多尺度的成像。

組織層面探索

科學(xué)家如今可以觀測到嚙齒動物軀體感覺皮質(zhì)小樣本中波狀的熒光變化

環(huán)路解剖

GEVIs可以用于追蹤果蠅腦在處理信息時，多個神經(jīng)元的電反應(yīng)

亞細(xì)胞觀測

用GEVIs可追蹤單個神經(jīng)元上動作電位傳遞至單個樹突的過程

如果能夠直觀地讀出細(xì)胞的膜電位，那么科學(xué)家們就可以對抑制神經(jīng)元活化的電信號進(jìn)行研究，而不是僅僅將研究局限于激活信號上。法國馬賽港地中海神經(jīng)生物學(xué)研究所的神經(jīng)生物學(xué)家羅莎·柯薩特（Rosa Cossart）指出：由于鈣離子成像等方法無法記錄抑制性信號，我們并不清楚這類型號是如何影響腦活動的。

柯薩特長年以來使用電極和鈣離子成像作為實(shí)驗(yàn)手段，如今她很希望試試GEVIs。她希望這些傳感器能幫助她在同一時間測量到活小鼠的多個神經(jīng)元間——至少50個——高速傳遞的電位變化?！斑@將有利于理解一組組神經(jīng)元是如何整合電信號——無論興奮性還是抑制性信號——來支持對腦發(fā)育和功能而言無比重要的活動?！?/p>

深層挑戰(zhàn)

過去5年中，“腦計劃”的財政資助加速了這一領(lǐng)域的進(jìn)步，“也發(fā)展出了更好的GEVIs技術(shù)?！彼固垢４髮W(xué)的蛋白質(zhì)工程師邁克爾·林（Michael Lin）表示。

新傳感器研發(fā)的同時，科學(xué)家還在進(jìn)行對大腦中傳播的快速電信號進(jìn)行精準(zhǔn)成像的研究。挑戰(zhàn)在于，現(xiàn)如今的技術(shù)僅僅對培養(yǎng)皿中的細(xì)胞或腦的表面組織有效，但是“哺乳動物的腦并不是透明的，”加州大學(xué)伯克利分校的物理學(xué)家吉娜比喻道，“它看起來像豆腐?！?/p>

隨著研究的深入，研究者轉(zhuǎn)向了更有侵入性的方法，譬如去除表面的一些組織或直接向腦中刺入微內(nèi)窺鏡這種微小的光學(xué)儀器。另一種非入侵性的替代方法，可以觀測1毫米內(nèi)的不透明組織，稱作雙光子顯微鏡。這一技術(shù)使用更長波長、更低能量的光，能夠深穿入組織。由于雙光子顯微鏡一次只能照射并記錄一個點(diǎn)，捕捉圖像的速度過慢而跟不上腦中快速的電位變化。但專家們相信技術(shù)的進(jìn)步將很快使人們看清GEVIs產(chǎn)生的信號。吉娜表示：“這絕對可行。”

如果能以各種方法來克服這些挑戰(zhàn)，那么無疑電壓成像將成為科學(xué)家測量腦活動的主流方法。“在一兩年內(nèi)，會有大量運(yùn)用電壓傳感器來研究生物現(xiàn)象的論文發(fā)表?！彼固垢４髮W(xué)的神經(jīng)生物學(xué)家托馬斯·克蘭迪寧（Thomas Clandinin）指出。有些人認(rèn)為這一技術(shù)甚至?xí)娲姌O，成為解決神經(jīng)元如何處理和整合信息相關(guān)問題的關(guān)鍵技術(shù)。

值得一提的是，新手研究者們大多相當(dāng)樂觀：波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院的博士后研究員霍克巴姆認(rèn)為，GEVIs終將成為研究細(xì)胞中不同部位對閾下信號反應(yīng)的首選方案。他計劃用電壓成像研究信號是如何改變神經(jīng)元間連接的，這是一個學(xué)習(xí)中的關(guān)鍵步驟?！斑@種可能性相當(dāng)振奮人心，”霍克巴姆說，“我當(dāng)初在顯微鏡下看到那耀眼的成像時，也曾興奮地繞著實(shí)驗(yàn)室跳起舞來，當(dāng)然后面的經(jīng)驗(yàn)告訴我：當(dāng)實(shí)驗(yàn)方法有效的時候，還是少歡呼為妙?！?/p>

資料來源 Nature