微RNA-502在胃癌中的表達及其臨床意義

劉吳瑕 施 洪 李秀林 羅天航 彭小波

胃癌是常見的惡性腫瘤，2012年在全球癌癥相關死亡中排名第3位，死亡人數(shù)達到723 000例［1］。我國胃癌發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤的第2位［2-3］。胃癌在組織學上存在高度異質性，闡明胃癌發(fā)病的分子機制是提高其治療率、改善患者預后的關鍵。國內(nèi)外研究結果表明，胃癌發(fā)生和發(fā)展與多種微RNA（mi RNA）的異常表達相關。mi RNA通過調控細胞分化和凋亡來影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。mi RNA可能成為腫瘤治療的新靶點［4-5］。本研究旨在分析mi RNA-502的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究經(jīng)上海長海醫(yī)院倫理委員會討論通過。收集2017年10月—2018年3月在上海長海醫(yī)院普外科進行手術治療的28例胃癌患者的病史資料和手術標本，所有標本均經(jīng)病理學檢查診斷證實。全部入組患者手術治療前均未行化學治療（以下簡稱化療）或放射治療（以下簡稱放療）。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 標本收集 所有入組的胃癌患者在術前抽取2 mL外周靜脈血測定癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）水平。手術標本在離體30 min內(nèi)送至上海長海醫(yī)院病理科，進行常規(guī)的病理學檢查、免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）染色。人表皮生長因子受體（HER）-2擴增狀態(tài)判定標準：HER-2蛋白質免疫組化染色結果示＋＋＋為有擴增，-或＋為無擴增；若HER-2蛋白質免疫組化染色結果為＋＋，則進一步行HER-2基因熒光原位雜交（FISH）檢測，若FISH檢測結果為紅色信號的總數(shù)與綠色信號的總數(shù)比值≥2為有擴增，＜2為無擴增。按照美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）腫瘤分期手冊（第八版）進行胃癌臨床分期。取患者的胃癌組織和距離癌邊緣＞5 c m的正常黏膜組織（癌旁組織），經(jīng)液氮處理后于-80℃貯存，檢測mi RNA-502相對表達量。

1.3 實時定量PCR檢測mi RNA-502的相對表達量 常規(guī)提取胃癌組織、癌旁組織中的RNA，用mi RNA反轉錄試劑盒合成互補DNA（c DNA）。用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒進行實時定量PCR。TRIzol RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；實時定量PCR試劑盒和SYBR?PremixTaq購自日本Ta KaRa公司。以U6作為內(nèi)參照，應用ABI7900實時熒光定量PCR儀自帶軟件分析，獲得擴增產(chǎn)物Ct值，Ct為反應的實時熒光強度達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，結果采用2一△△Ct法分析mi RNA的相對表達量。mi RNA-502正向引物為5'-CGG GCA TCC TTG CTA TCT G-3'，反向引物為5'-CAG CCA CAA AAG AGC ACA AT-3'；內(nèi)參U6正向引物為5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，反向引物為5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。PCR擴增mi RNA反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸8 min，于4℃保存。實驗重復3次取平均值。

1.4 mi RNA-502相對表達量的比較 比較胃癌組織與癌旁組織中mi RNA-502的相對表達量。比較不同性別、年齡（≤60歲和＞60歲）、癌組織HER-2蛋白質表達（擴增和未擴增）、血清CEA（＜5μg/L和≥5μg/L）、血清CA19-9（＜39 U/mL和≥39 U/mL）、胃癌T分期（T1～2期和T3～4期）、淋巴結轉移（有或無）患者癌組織mi RNA-502的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用Graph Pad Pris m 5.0和SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，配對資料的比較采用配對t檢驗，不同臨床病理特征患者的胃癌組織mi RNA-502相對表達量的比較采用t檢驗。多因素分析采用COX多元回歸模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中mi RNA-502的相對表達量 癌旁組織、胃癌組織中mi RNA-502的相對表達量分別為3.66±1.99、1.97±1.82，胃癌組織中mi RNA-502相對表達量顯著低于癌旁組織（P＜0.01）。

2.2 不同臨床病理特征的胃癌患者癌組織的mi RNA-502的表達 28例入組患者的中位年齡為67歲。T1～2期和無淋巴結轉移患者癌組織中mi RNA-502的相對表達量分別顯著高于T3～4期（P＜0.001）和有淋巴結轉移（P＝0.03）的患者，而不同年齡、性別、癌組織HER-2蛋白質表達、血清CEA和血清CA19-9水平的患者癌組織中mi RNA-502相對表達量的差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05），見表1。

2.3 mi RNA-502的表達與胃癌臨床病理特征關系的多因素分析 將上述因素導入COX多元回歸模型，結果顯示，mi RNA-502的表達量與胃癌T分期顯著相關［風險比（HR）＝1.62，95%CI為1.34～1.96，P＝0.028］，而與年齡、性別、癌組織 HER-2蛋白質表達、血清CEA水平、血清CA19-9水平和淋巴結轉移狀態(tài)均不相關（P值均＞0.05）。

表1 不同臨床病理特征的胃癌患者癌組織mi RNA-502的表達比較（N＝28，±s）

表1 不同臨床病理特征的胃癌患者癌組織mi RNA-502的表達比較（N＝28，±s）

臨床病理特征 nmi RNA-502相對表達量 P值17 2.24±1.90 0.15女11 1.38±0.83年齡≤60歲 9 1.36±1.12 0.23＞60歲 19 2.16±1.89癌組織HER-2蛋白質表達無擴增 24 1.80±1.58 0.46擴增 4 2.47±1.43血清CEA水平＜5μg/L 20 2.13±1.33 0.25≥5μg/L 8 1.34±0.91血清CA19-9水平＜39 U/mL 21 2.15±1.70 0.10≥39 U/mL 7 1.15±0.81 T分期T 1～2期 4 4.87±1.55 ＜0.001 T 3～4期 24 1.40±1.00淋巴結轉移無4 3.47±2.46 0.03有性別男24 1.64±1.19

3 討 論

胃癌發(fā)病率和惡性程度均位居惡性腫瘤前列，嚴重危害人類身體健康，也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。胃癌的發(fā)生和發(fā)展是受遺傳、環(huán)境、飲食、生活習慣等多因素影響的復雜過程，受到多種基因調控，涉及多個基因的表達或者失活［6-8］。

mi RNA是非編碼的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，廣泛存在于多種真核生物中，通過結合特定靶基因信使RNA（mRNA）的3'非編碼區(qū)，調控基因轉錄后的表達，在基因翻譯水平實現(xiàn)對靶基因表達的負調控，并可以通過特定機制，參與腫瘤的發(fā)生和演進。成熟的mi RNA含20個堿基，具有調節(jié)基因表達活性的功能［9］。研究［10］結果表明，mi RNA作為一種重要的轉錄后調控因子，廣泛地參與腫瘤相關基因的調控，在腫瘤的診斷、治療方面扮演重要角色。

近年發(fā)現(xiàn)，mi RNA與胃癌患者淋巴結轉移、疾病進展、復發(fā)、生存時間均存在相關性。Chen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，有遠處轉移的胃癌患者血漿mi RNA-122水平顯著降低，mi RNA-192的水平顯著升高（P＜0.01）；Cox回歸分析結果顯示，血漿mi RNA-122高表達是胃癌預后較好的獨立預測因素，而mi RNA-192水平與患者總生存期無相關性。Yan等［12］發(fā)現(xiàn)mi RNA-335可以作為鑒定胃癌是否復發(fā)的指標，其靈敏度和特異度分別為0.871和0.791。Zhang等［13］觀察胃癌患者術后血漿mi RNA的水平發(fā)現(xiàn)，與低mi RNA-375且高mi RNA-142-5p表達的患者相比，高mi RNA-375且低mi RNA-142-5p表達的患者中位生存期明顯縮短，表明聯(lián)合mi RNA-375和mi RNA-142-5p可以預測手術切除后胃癌患者的疾病進展。Qiu等［14］發(fā)現(xiàn)，mi RNA-26a和 mi RNA-148a的下調與患者總生存期縮短顯著相關（P＝0.011），且Cox回歸分析結果表明兩者均是胃癌的獨立預后因素。因此，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，研究mi RNA及其相關的調控機制有切實的臨床意義。

既往研究［15］結果提示，mi RNA-502可以通過抑制自噬來抑制結腸癌細胞增殖；mi RNA-502在乳腺癌中的表達水平顯著低于癌旁組織，通過下調腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）發(fā)揮促進乳腺癌細胞凋亡和抑制乳腺癌細胞增殖的作用［16］。Chen等［17］發(fā)現(xiàn)，mi RNA-502表達下調與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關，mi RNA-502通過靶向下游磷脂酰肌醇3-激酶γ（PIK3CG）抑制肝癌細胞增殖、G1/S期細胞周期阻滯和促進肝癌細胞凋亡。

目前，鮮見mi RNA-502在胃癌中的研究。本研究通過實時定量PCR方法檢測28例胃癌及其癌旁組織中的mi RNA-502表達，發(fā)現(xiàn)癌組織中mi RNA-502的表達顯著低于癌旁組織，這與之前的mi RNA-502在結直腸癌、乳腺癌和肝癌中的報道一致［15-17］。進一步比較不同年齡、性別、癌組織HER-2蛋白質表達、血清CEA、血清CA19-9、胃癌T分期，以及有無淋巴結轉移患者的胃癌組織中mi RNA-502表達量，結果提示mi RNA-502的相對表達量與腫瘤T分期、淋巴結轉移情況顯著相關。進一步行多因素分析顯示，mi RNA-502的表達量僅與胃癌T分期顯著相關，而與其他因素均不相關。研究結果表明，在胃癌的發(fā)展過程中mi RNA-502逐漸丟失，mi RNA-502在胃癌發(fā)病中可能起到抑癌基因作用。

本研究初步探討了mi RNA-502在胃癌中的表達及其與主要臨床病理特征的關系，但關于mi RNA-502在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中的具體表達變化，及其相關的調控機制目前仍有待于進一步研究確定。能否為胃癌的診斷和進展判斷提供一個新的潛在的標志物，則期待更大樣本的研究。