清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜技術(shù)研究

劉厚權(quán) 張俊英 毛艷艷 毛艷峰 胡吉忠 楊濤

（江西普正制藥有限公司 吉安331409）

清熱散結(jié)膠囊是采用千里光單味藥材生產(chǎn)的中成藥，具有消炎解毒、散結(jié)止痛的作用，可用于急性結(jié)膜炎、急性咽喉炎、急性菌痢、上呼吸道炎、急性支氣管炎、急性扁桃腺炎、淋巴結(jié)炎、皮炎濕疹、中耳炎等的治療[1]。千里光藥材收載于2015年版《中國藥典》，其主要以金絲桃苷作為指標(biāo)性成分來控制質(zhì)量[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道，千里光藥材中含有槲皮素、木犀草苷、蘆丁、千里光堿、阿多尼弗林堿等成分[3]。清熱散結(jié)膠囊以綠原酸為主要指標(biāo)性成分來進(jìn)行質(zhì)量控制，目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品內(nèi)在品質(zhì)，因此本研究選擇千里光中多種有效成分如金絲桃苷、槲皮素、綠原酸、木犀草素等[4～5]進(jìn)行定性分析，并建立高效液相色譜指紋圖譜，以多種有效成分的含量來評價產(chǎn)品的品質(zhì)，更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保障產(chǎn)品的臨床療效和用藥安全。現(xiàn)報道如下：

1 儀器、試藥與樣品信息

1.1 儀器 AB104-N萬分之一天平（梅特勒-托利多）；AUW2200十萬分之一天平（SHIMADZU）；KQ3200超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Mili-Q超純水儀（Milipore公司）；Waters2695高效液相色譜儀（Waters公司）。

1.2 試劑 甲醇：分析純，上海振興化工一廠；乙腈：色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；磷酸：分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.3 對照品 綠原酸：110753-201415，中國食品藥品檢定研究院；金絲桃苷：111521-201507，中國食品藥品檢定研究院；槲皮素：100081-201408，中國食品藥品檢定研究院；木犀草苷：111720-201408，中國食品藥品檢定研究院。

1.4 藥材 千里光藥材購置于樟樹藥材市場，經(jīng)江西普正制藥有限公司吳永忠研究員鑒定為千里光（Senecio scandens Buch.-Ham）。

1.5 清熱散結(jié)膠囊樣品 江西普正制藥有限公司生產(chǎn)的清熱散結(jié)膠囊產(chǎn)品，批號有：121101、121102、121103、121104、121201、121202、130702、130703。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、木犀草苷對照品2.5 mg，加入75%甲醇50 ml充分溶解、稍振搖，作為對照品溶液。

2.1.2 清熱散結(jié)膠囊供試品溶液制備 取清熱散結(jié)膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，充分研磨成細(xì)粉后放置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，稱重，超聲處理（功率 250 W，頻率 50 kHz）30 min，取出，然后冷卻至室溫，用75%甲醇彌補(bǔ)足損失的重量，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.3 藥材供試品溶液制備 取千里光藥材1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 ml，稱定重量，于75～85℃水浴加熱回流1 h，取出，放冷，用75%甲醇彌補(bǔ)損失的重量，濾過，取濾液作為千里光藥材對照品溶液。

2.1.4 千里光浸膏樣品溶液制備 按照清熱散結(jié)膠囊生產(chǎn)制備工藝，取中間產(chǎn)品浸膏粉0.4 g，精密稱定，加入75%甲醇20 ml，稱量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，取出，冷卻至室溫，用75%甲醇彌補(bǔ)足損失的重量，濾過，取濾液作為千里光浸膏粉對照品溶液。

2.2 高效液相色譜條件 儀器：Waters高效液相色譜儀（Waters2695分離單元，Waters2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站）；色譜柱：ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長 0 min∶220 nm，15 min∶280 nm，30 min∶325 nm，40 min∶360 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈為流動相A，0.05%磷酸水溶液為流動相B，按表1梯度洗脫。

表1 梯度洗脫體積比濃度配置

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性 分別取各對照品溶液、清熱散結(jié)膠囊樣品溶液、藥材的供試品溶液、千里光浸膏溶液及空白溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀中，按照高相液相色譜法進(jìn)樣測定分析。通過對比各樣品的高效液相色譜圖譜，清熱散結(jié)膠囊供試品溶液中只檢出綠原酸，而千里光藥材和浸膏中可以檢出金絲桃苷和綠原酸，兩者均未能檢出槲皮素、木犀草苷、木犀草素。見圖1～圖8。

圖1 清熱散結(jié)膠囊樣品色譜圖譜

圖2 千里光藥材

圖3 千里光浸膏樣品色譜圖

圖4 金絲桃苷對照品色譜圖

圖5 綠原酸對照品色譜圖

圖6 槲皮素對照品色譜圖

圖7 木犀草苷和木犀草素混合對照品色譜圖

圖8 空白對照色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取批號121104清熱散結(jié)膠囊樣品，根據(jù)上述樣品溶液制備方法制備清熱散結(jié)膠囊樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，將5次進(jìn)樣供試品樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012年版相似度軟件，進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示相似度在0.95以上，說明儀器精密度良好。見表2。

表2 連續(xù)五次進(jìn)樣相似度分析

2.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取批號130702的清熱散結(jié)膠囊樣品，根據(jù)上述樣品溶液制備方法制備清熱散結(jié)膠囊樣品溶液，平行制備溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣，將6份進(jìn)樣供試品樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》相似度軟件，進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示相似度在0.95以上，說明本方法重現(xiàn)性良好。見表3。

表3 平行樣品相似度分析

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號121202的清熱散結(jié)膠囊樣品，根據(jù)上述樣品溶液制備方法制備清熱散結(jié)膠囊樣品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣。將6次進(jìn)樣供試品樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》相似度軟件，進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示相似度在0.95以上，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表4。

表4 不同時間段相似度分析

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 取8批清熱散結(jié)膠囊樣品，根據(jù)上述樣品溶液制備方法制備清熱散結(jié)膠囊樣品溶液，分別精密吸取供試品溶液5 μl，分別注入液相色譜儀，獲得各批次清熱散結(jié)膠囊的HPLC圖譜。將8批清熱散結(jié)膠囊圖譜作為清熱散結(jié)膠囊參照指紋圖譜。其中共有12個特征共有峰，12個特征共有峰的平均保留時間如表5所示，圖譜總長度為60 min。對比綠原酸對照品圖譜我們得出峰7為綠原酸。見圖9和表5。

圖9 清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜

表5 特征共有峰保留時間

2.5.2 相似度評價 將8批清熱散結(jié)膠囊色譜數(shù)據(jù)和清熱散結(jié)膠囊對照指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》相似度軟件進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示不同批次清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜的相似度大于0.9，說明各批次樣品的化學(xué)成分一致性較好，說明江西普正制藥有限公司生產(chǎn)的清熱散結(jié)膠囊產(chǎn)品批間穩(wěn)定性較好，產(chǎn)品質(zhì)量均一性較好。見表6和圖10。

表6 不同批次清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

圖10 不同批次清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜相似度評價

3 討論

本研究建立的清熱散結(jié)膠囊的高效液相指紋圖譜共有12個特征峰，可以表征產(chǎn)品的有效成分，該方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性較好，可以作為清熱散結(jié)膠囊的質(zhì)量控制方法。本研究結(jié)果表明，不同生產(chǎn)批次的清熱散結(jié)膠囊指紋圖譜相似度在0.9以上，批次間相似度較好，說明江西普正制藥有限公司生產(chǎn)的清熱散結(jié)膠囊批間均一性較好，產(chǎn)品臨床療效穩(wěn)定，安全性較好。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱散結(jié)膠囊樣品中只檢出綠原酸，而千里光藥材和浸膏中可以檢出金絲桃苷和綠原酸，但未能檢出槲皮素、木犀草苷、木犀草素，這其中的原因還需要進(jìn)一步研究。