負壓滲透處理對花粉管加載熒光染料的影響

李 坤，王永章，屈海泳

(青島農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山東青島 266109)

開花植物受精過程中，花粉在柱頭萌發(fā)并伴隨花粉管的生長將花粉管內(nèi)部的精子注入雌蕊的胚中從而完成受精[1]?；ǚ勖劝l(fā)以及生長過程中都離不開Ca2+參與，關(guān)于Ca2+對花粉管生長重要性的研究自20世紀60年代就已經(jīng)有報道，其不僅與花粉的萌發(fā)、花粉管的伸長緊密相關(guān)，而且還通過細胞內(nèi)外復雜的信號網(wǎng)絡參與花粉與柱頭間的信號識別及受精過程[2-4]。有研究表明，體外培養(yǎng)3種相思花粉(Acaciaauriculiformis,Acaciamangium和Acaciacrassicarpa) 時，Ca2+的濃度過高或過低都會導致花粉管生長出現(xiàn)畸形，花粉管的正常生長需要Ca2+濃度維持在一個適當?shù)姆秶鶾5]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，在花粉管尖端部位由Ca2+內(nèi)流所形成的從尖端到基部的Ca2+濃度梯度是花粉管正常生長所必須[6]。同時，Ca2+會在花粉管尖端聚集，與質(zhì)子及其他離子維持動態(tài)平衡，為花粉管正常的極化生長提供基礎(chǔ)[7]?；ǚ酃苤行纬傻腃a2+濃度梯度不僅可以保證花粉管在花柱中極性生長并成功到達胚，同時還支配著尖端離子流動、囊泡運輸以及細胞骨架的動態(tài)變化，確保花粉管尖端適度的極性生長來正確定位到雌蕊的胚，及時釋放出精子細胞[8-9]。

植物細胞中游離的Ca2+及其結(jié)合的蛋白質(zhì)是植物信號網(wǎng)絡內(nèi)重要的組成者和參與者，植物細胞質(zhì)中Ca2+濃度易受環(huán)境刺激而發(fā)生變化，并影響細胞的發(fā)育和生長[10-11]。在植物受刺激的情況下，細胞質(zhì)中的Ca2+濃度很容易發(fā)生短暫的變化，而且花粉管尖端伸長過程中，也需要胞外Ca2+內(nèi)流維持尖端的Ca2+梯度，但目前關(guān)于Ca2+流動機制尚不甚清楚，需要探索一個穩(wěn)定有效的監(jiān)測方法來監(jiān)測花粉管生長過程中Ca2+動態(tài)變化。因此探究一種可以用來準確反映植物細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的試驗方法就顯得尤為重要，這有助于進一步揭示Ca2+在細胞內(nèi)的功能及其流動機制[12]。

Ca2+的熒光成像技術(shù)是用來研究細胞內(nèi)Ca2+作用的一種比較直觀有效的方法。目前植物細胞中的Ca2+熒光成像方法主要有兩種：一種是以基因編碼的綠色熒光蛋白為Ca2+指示劑成像方法，但此種方法需進行基因轉(zhuǎn)化且耗時太長；另一種是使用具有熒光的有機小分子探針[8, 13-14]。常采用的小分子探針是Fluo-3、Fluo-4等，將這些小分子探針與乙酰甲酯結(jié)合易于透過動物細胞的細胞膜。但在植物細胞中，這些小分子探針易與活細胞細胞壁中含有的酯酶發(fā)生酶解作用而使探針不易透過細胞膜，因此有大量研究關(guān)于熒光試劑如何透過細胞膜，進入細胞內(nèi)與鈣結(jié)合產(chǎn)生熒光[15]。Ca2+熒光成像的效果很大程度上依賴于探針加載的方法，為促進這些小分子探針進入植物細胞，一種方法是通過顯微注射的方法直接將探針注入細胞內(nèi)，但這種方法對設(shè)備儀器和研究人員的熟練程度的要求比較高，不利于廣泛使用。另一種常用的方法是低溫加載法，可避免細胞中酯酶的酶解作用，但耗費時間偏長，一般需要過夜等[16-17]。目前用于檢測花粉管細胞內(nèi)Ca2+的探針或方法，在探針透過花粉細胞壁結(jié)合胞內(nèi)Ca2+時大部分對花粉粒細胞結(jié)構(gòu)造成傷害，使花粉活性降低[6, 12]。

目前有許多與負壓滲透相關(guān)的報道，如通過負壓輔助的方法促進基因載體滲透進入細胞，可以在無植物組織培養(yǎng)和再生的情況下獲得基因轉(zhuǎn)化株[18-19]。也有報道成功使用負壓轉(zhuǎn)化的方法進行不同種類植物的基因轉(zhuǎn)化[20-22]。在負壓條件下，細菌可以滲透進入到植物的部分器官進行轉(zhuǎn)化，顯著提高基因轉(zhuǎn)化效率[23]。受此啟發(fā)，本文探索在不影響花粉細胞結(jié)構(gòu)和活性的情況下，采用負壓滲透的方法改變加載的物理條件來促進熒光探針進入花粉細胞，檢測花粉細胞內(nèi)Ca2+濃度變化。

1 材料和方法

1.1 試驗材料的收集及培養(yǎng)

本試驗以豐水梨(PyruspyrifoliaNakai. cv. Hosui)的花粉為實驗材料，在山東省果樹研究所的試驗果園收集，將開花前一天或當天即將開花的梨樹花蕾取下，待花藥自然散開后收集花粉，干燥后儲存于-20 ℃條件下備用?；ǚ叟囵B(yǎng)參考屈海泳等的方法[24]，花粉培養(yǎng)液中含有成分為1 mmol/L KNO3、0.55 mmol/L Ca(NO3)2、1.6 mmol/L H3BO3、1.6 mmol/L MgSO4和440 mmol/L蔗糖， pH值為6.0～6.2。

1.2 細胞內(nèi)鈣檢測

Ca2+濃度檢測采用熒光探針Fluo-4/AM(Dojindo Laboratories，日本)進行。Fluo-4/AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，F(xiàn)luo-4/AM自身不具熒光，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)可以穿透細胞膜，AM進入細胞后會被胞內(nèi)酯酶水解，產(chǎn)生的Fluo-4具有足夠敏感性，與Ca2+結(jié)合時熒光強度會增加100倍，可以用來監(jiān)測報告細胞內(nèi)游離的低濃度Ca2+[25]。

1.3 花粉管負壓下加載熒光染料的方法

將50 μg的Fluo-4/AM溶解在91.2 μL的無水二甲基亞砜中，于-20 ℃條件下避光密封保存，得到Fluo-4/AM母液；將-20 ℃條件下密閉保存的花粉于常溫放置2 h，與培養(yǎng)液混勻至最終濃度為1×105～1×107?；ǚ?mL，于25 ℃條件下分別培養(yǎng)0.5 h和2 h，得到花粉粒懸浮液和花粉管懸浮液。

1.3.1花粉管負壓加載熒光探針分別取2 μL的Fluo-4/AM母液和98 μL培養(yǎng)2 h的花粉管懸浮液放置于0.2 mL微量離心管中，混勻。然后將加入Fluo-4/AM母液和花粉懸浮液的離心管打開蓋子分別置于4 ℃和25 ℃的真空干燥箱中，在負壓條件下(-80 kPa)避光培養(yǎng)0.5～2 h，然后打開裝置恢復到常壓。對照為常壓下不同溫度的培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的離心管進行離心，10 000 r·min-1離心1 min，棄去上清，用不含F(xiàn)luo-4/AM的培養(yǎng)液洗滌3次。

1.3.2花粉粒負壓加載熒光探針另取2只0.2 mL微量離心管加入98 μL培養(yǎng)0.5 h的花粉粒懸浮液，分別加入2 μL的Fluo-4/AM母液和2 μL花粉培養(yǎng)液，重復上述1.3.1的過程。對照加入100 μmol/L Fluo-4/AM在常壓(4 ℃)條件下培養(yǎng)相同時間。

1.3.3顯微鏡觀察使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，德國)觀察花粉管染色情況。檢測時使用的激發(fā)波長為488 nm左右，發(fā)射波長為500～550 nm。

1.4 花粉萌發(fā)及花粉管活性的檢測

在離心管中加入花粉和培養(yǎng)液后放置在負壓(4 ℃)條件下處理2 h，之后放置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。對照不進行負壓處理直接置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在低倍鏡下隨機選取3個視野(重復)統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，每個視野統(tǒng)計10個花粉。

使用紅墨水進行染色，參考劉葦?shù)鹊姆椒╗26]，略有修改。具體操作：將負壓條件下處理的花粉置于10% 的紅墨水中，室溫放置10 min，顯微鏡下進行觀察統(tǒng)計。根據(jù)花粉細胞質(zhì)膜的選擇透過性和對探針選擇吸收的能力來判斷花粉的活性，喪失活性的花粉易被染色，而活力較強的正?；ǚ鄄荒鼙蝗旧?。

1.5 Cd2+、La3+和EGTA對熒光的影響

Cd2+、La3+常被用作Ca2+通道抑制劑來觀察植物細胞內(nèi)Ca2+濃度變化[27]。在Fluo-4/AM加載完成后，分別在懸浮液中添加終濃度為10、100、1 000 μmol/L的 Cd2+和La3+，室溫放置15 min進行觀察。另外，在Fluo-4/AM加載完成的懸浮液中加入終濃度為10、100、1 000 μmol/L的Ca2+螯合劑EGTA(C14H24N2O10)，室溫放置15 min進行觀察。以正常培養(yǎng)負壓加載Fluo-4/AM后的花粉作為對照。

1.6 圖像分析

熒光圖像使用軟件Image-Pro Plus software和Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Mountain View, CA)進行分析處理，方法參考屈海泳等[24]。數(shù)據(jù)分析使用軟件Microsoft Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 負壓滲透處理后對花粉活性及花粉粒加載Fluo-4/AM的影響

為驗證負壓是否會影響花粉萌發(fā)，將花粉懸浮液先在負壓條件下培養(yǎng)2 h，發(fā)現(xiàn)花粉可以正常萌發(fā)(圖1，A、B)，對花粉萌發(fā)率進行統(tǒng)計，結(jié)果負壓條件下的萌發(fā)率為15.7%，與正常萌發(fā)的萌發(fā)率(對照)16.0%相比無顯著差異(圖1，E)。為驗證負壓是否會對已萌發(fā)的花粉管的活性產(chǎn)生影響，將負壓條件下培養(yǎng)2 h的花粉使用紅墨水進行染色發(fā)現(xiàn)，在負壓條件下培養(yǎng)2 h的花粉管與沒有負壓培養(yǎng)的花粉管相同，都沒有被染成紅色(圖1，C、D)，表明負壓處理2 h對花粉的萌發(fā)及花粉管生長并無影響。

加入Fluo-4/AM之后的花粉懸浮液，在負壓(4 ℃)條件下培養(yǎng)30 min，然后恢復常壓。在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察發(fā)現(xiàn)，花粉粒在經(jīng)負壓處理后，含有Fluo-4/AM的懸浮液中有比較明亮的熒光(圖2，A)，而常壓處理和不含F(xiàn)luo-4/AM的懸浮液中的花粉粒熒光非常微弱(圖2，B、C)，這表明負壓條件能促進探針Fluo-4/AM進入花粉粒。

A．對照，正常培養(yǎng)2 h的花粉生長狀況；B．負壓處理2 h后培養(yǎng)2 h的花粉生長狀況；C．花粉正常培養(yǎng)2 h后，負壓處理2 h后用紅墨水染色；D．花粉正常培養(yǎng)2 h后，用紅墨水染色,不進行負壓處理；E．花粉萌發(fā)率(每組3次重復，每重復統(tǒng)計10個花粉，標尺=50 μm，P < 0.05)圖1 負壓滲透對花粉活性的影響A. Control, the pollens growing in normal culture for 2 h; B. The pollens were cultured for 2 h after vacuum infiltration treatment for 2 h; C. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink after vacuum infiltration treatment for 2 h; D. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink without vacuum infiltration treatment. E. Pollen germination rate (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen, bar=50 μm, P < 0.05)Fig.1 Effect of vacuum infiltration on pollen activity

2.2 花粉管負壓滲透條件及滲透時間對Fluo-4/AM加載的影響

為研究花粉管加載Fluo-4/AM時，最適的負壓滲透條件，將培養(yǎng)后的花粉進行了不同時間和不同條件下的加載處理。在加入Fluo-4/AM之前花粉管不含熒光(圖3，A、B)；培養(yǎng)2 h的花粉加入Fluo-4/AM負壓處理15 min后，花粉管尖端部分含有微弱熒光信號(圖3，C、D)；在加入Fluo-4/AM負壓處理30 min后，花粉管從基部到尖端出現(xiàn)比較明顯的熒光信號和梯度變化，而且在尖端區(qū)域更加明顯(圖3，E、F)；在負壓中處理1 h后，整個花粉管充滿熒光，花粉管Ca2+梯度消失(圖3，G、H)。表明在負壓處理30 min后可以促進Fluo-4/AM進入花粉管中，若延長處理時間，則會導致花粉管Ca2+梯度消失。

A.加入Fluo-4/AM后負壓滲透處理的花粉粒；B.沒有添加Fluo-4/AM的花粉粒(對照)；C.添加Fluo-4/AM常壓條件放置的花粉粒圖2 負壓滲透對花粉粒中Fluo-4/AM加載的影響A. After adding Fluo-4 /AM, the pollen grains were treated by vacuum infiltration; B. Control, the pollen grains without Fluo-4 /AM; C. Under the normal pressure condition after adding Fluo-4/AMFig.2 Effect of vacuum infiltration on Fluo-4 /AM loading in pollen grains

A和B.對照，沒有添加Fluo-4/AM的花粉管；C和D.負壓滲透處理15 min；E和F.負壓滲透處理30 min；G和H.負壓滲透處理1 h圖3 負壓滲透時間對花粉管中Fluo-4/AM加載的影響A and B. Control, pollen tube without Fluo-4 /AM; C and D. Vacuum infiltration treatment for 15 min; E and F. Vacuum infiltration treatment for 30 min; G and H. Vacuum infiltration treatment for 1 hFig.3 Effect of vacuum infiltration time on Fluo-4 /AM loading in the pollen tube

在正常培養(yǎng)2 h后的花粉管懸浮液中加入Fluo-4/AM，放置于常壓和負壓及4 ℃和25 ℃的條件下培養(yǎng)30 min發(fā)現(xiàn)，在室溫(25 ℃)條件下，低壓處理后可觀察到部分熒光(圖4，A、B)，而常壓處理的花粉管中含有微弱的熒光(圖4，C、D)，且主要分布在花粉管的邊緣區(qū)域。另外，可以觀察到在低溫(4 ℃)條件下，經(jīng)過低壓處理的花粉管具有明亮的熒光，從尖端到基部的熒光密度存在由高到低的梯度變化(圖4，E、F)，而常壓條件下的花粉管雖然可觀察到有熒光，但熒光較弱且無梯度變化(圖4，G、H)。說明低壓有助于探針透過花粉管質(zhì)膜進入花粉管與Ca2+結(jié)合。低壓情況下低溫的熒光明顯高于室溫條件下，也表明低溫對探針進入質(zhì)膜同樣有促進作用。

2.3 花粉管負壓滲透處理加載Fluo-4/AM與F-127輔助加載比較

Pluronic F-127 (F-127)是一種較常用的可提高細胞滲透性的活性劑，常用來協(xié)助熒光探針進入細胞內(nèi)[25]。取0.1 mL培養(yǎng)2 h的花粉懸浮液加入100 μmol/L Fluo-4/AM和0.2% F-127，在4 ℃條件下進行輔助加載2 h。與負壓輔助加載相比，2種方法都能很好地反映花粉管中的Ca2+濃度梯度(圖5，A～D)，加入F-127的花粉管尖端區(qū)域的熒光密度低于負壓條件下加載的花粉管尖端的熒光密度，但差異不顯著(圖5，E)。說明負壓條件下加載可以促進Fluo-4/AM進入細胞結(jié)合Ca2+，相較于使用F-127加載2 h，負壓加載可以明顯縮短加載時間。

2.4 La3+、Cd2+和EGTA處理后花粉管Ca2+梯度的變化

Cd2+和La3+處理可以抑制Ca2+離子通道。使用不同濃度的La3+對負壓加載Fluo-4/AM的花粉管進行處理，發(fā)現(xiàn)在10 μmol/L的La3+處理時花粉管尖端Ca2+熒光密度顯著降低，花粉管尖端的Ca2+梯度被破壞(圖6，A～D、K)。另外，10 μmol/L的Cd2+處理時花粉管尖端到基部仍存在Ca2+濃度從高到低的梯度變化，但花粉管尖端所含的熒光密度明顯降低(圖6，A、B、E、F、L)，100 μmol/L、1 000 μmol/L的Cd2+處理后花粉管尖端的Ca2+梯度變化被破壞(圖6，G、H、I、J)。

在使用10 μmol/L的Ca2+螯合劑EGTA處理時，對花粉管尖端的熒光密度并無顯著變化，但對花粉管尖端Ca2+梯度產(chǎn)生影響，而100 μmol/L、1 000 μmol/L的EGTA處理時，花粉管尖端的熒光密度相較于10 μmol/L的EGTA處理出現(xiàn)了明顯下降(圖7)，說明細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，這可能是由于EGTA螯合胞外Ca2+，導致花粉管細胞外部Ca2+濃度降低，減少了Ca2+向細胞內(nèi)的運輸。

3 討 論

花粉管的正常生長需要細胞內(nèi)外Ca2+共同參與，胞內(nèi)外Ca2+濃度變化對花粉管生長具有重要調(diào)節(jié)作用[28]。Ca2+熒光探針和Ca2+成像是研究細胞中Ca2+動態(tài)變化的重要方法，然而由于植物細胞細胞壁的存在使得大多數(shù)探針難以穿過活細胞的細胞壁，進入后又易在液泡聚集，不能準確地反映活細胞內(nèi)Ca2+濃度的信息[29]。

目前植物細胞Ca2+成像最成功和廣泛使用的技術(shù)是顯微注射技術(shù)，將熒光探針直接微注射到植物細胞的細胞質(zhì)中，但這種方法對操作者的技術(shù)要求較高，而且操作過程非常繁瑣和耗時[30]。另外，使用顯微注射技術(shù)對植物原生質(zhì)體中的Ca2+加載時，由于原生質(zhì)體失去了細胞壁和極性，它們的反應可能并不能準確反映其生理機制[31]。雖然目前存在許多熒光探針與具有細胞滲透性的乙酰甲酯結(jié)合可以透過細胞壁，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的使用可以檢測不同刺激下植物細胞中Ca2+的空間分布變化，但是這種探針又必須在低溫條件下進行，以此來避免細胞中酯酶對探針的酶解作用，因此導致這一類熒光探針加載時間較長，試驗效率較低[24]。本研究中，負壓滲透不影響花粉正常萌發(fā)生長，而且可以促進了熒光探針跨過花粉細胞壁進入花粉管，并沒有破壞花粉細胞的結(jié)構(gòu)和細胞活性，但隨著負壓滲透時間的延長可能會對花粉管存在傷害。有研究表明，在使用Fluo-4/AM加載細胞質(zhì)中Ca2+時，隨著加載時間的延長，F(xiàn)luo-4/AM會受細胞內(nèi)區(qū)室化的影響在細胞器內(nèi)聚集，但這種情況可以通過低溫條件下、縮短加載時間來避免[32]。本研究采用低溫條件下負壓滲透的方法，可以降低植物細胞壁中的酯酶對AM的酶解作用使Fluo-4/AM容易透過細胞壁加載到植物細胞中，避免熒光探針進入細胞時被水解及進入細胞后區(qū)室化的影響[33]。另外，在負壓條件下，介質(zhì)中各物質(zhì)分子發(fā)生失重而四處飄游,增加了各分子間接觸和碰撞的機會，使分子間的結(jié)合變得更加容易[34]。在此條件下熒光探針更容易和花粉管中的Ca2+結(jié)合使反應加速完成進一步提高染色的效率，但是需控制負壓處理的時間，時間過長會對實驗結(jié)果產(chǎn)生很大影響。

A和B.低壓室溫條件下處理30 min；C和D.常壓室溫條件下處理30 min；E和F.低壓低溫條件下處理30 min；G和H.低壓室溫條件下處理30 min圖4 壓強和溫度對Fluo-4/AM加載的影響A and B. Under low pressure room temperature for 30 min; C and D. Normal pressure at room temperature for 30 min; E and F. Under low temperature and low pressure condition for 30 min; G and H. Under low pressure room temperature for 30 minFig.4 The effect of pressure and temperature on Fluo-4 /AM loading

A和B.負壓滲透處理30 min；C和D.F-127處理2 h；E.負壓滲透和F-127處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計分析 (每組3次重復，每重復統(tǒng)計10個花粉管，P < 0.05)圖5 F-127處理對花粉管中Ca2+濃度的影響A and B. Vacuum infiltration treatment for 30 min; C and D. F-127 treatment for 2 h; E. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube after the vacuum infiltration and F-127 treatment (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.5 Effects of F-127 treatment on Ca2+ concentration in pollen tubes

A和B.對照，負壓下加載染料的花粉管；C和D.10 μmol/L的La3+處理；E和F.10 μmol/L的Cd2+處理；G和H.100 μmol/L的Cd2+處理；I和J.1 000 μmol/L的Cd2+處理；K.不同濃度La3+處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計分析；L.不同濃度Cd2+處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計分析(每組3次重復，每重復統(tǒng)計10個花粉管，P < 0.05)圖6 La3+、Cd2+對花粉管中Ca2+濃度的影響A. and B. Control, pollen tubes loaded with dye under vacuum; C and D. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L La3+; E and F. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L Cd2+; G and H. The pollen tubes were treated with 100 μmol/L Cd2+; I and J. The pollen tubes were treated with 1 000 μmol/L Cd2+; K. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration La3+ treatments; L. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration Cd2+ treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.6 Influence of different concentrations of La3+ and Cd2+ on Ca2+ concentration in pollen tube

花粉管負壓滲透加載Fluo-4/AM后不同濃度EGTA處理:A和B.對照，不含EGTA；C和D.10 μmol/L EGTA；E和F.100 μmol/L EGTA；G和H.1 000 μmol/L EGTA；I.不同濃度EGTA處理后花粉管尖端熒光值的統(tǒng)計分析(每組3次重復，每重復統(tǒng)計10個花粉管，P<0.05)圖7 不同濃度EGTA對花粉管中Ca2+濃度的影響After vacuum infiltration loading Fluo-4 /AM, the pollen tubes were treated with different concentrations of EGTA: A and B. Control, without EGTA; C and D. 10 μmol/L EGTA; E and F. 100 μmol/L EGTA; G and H. 1 000 μmol/L EGTA; I. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration EGTA treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P<0.05)Fig.7 Influence of different concentrations of EGTA on Ca2+ concentration in pollen tube

雖然F-127常用來促進乙酸甲酯(AM)類Ca2+熒光探針進入細胞，在細胞內(nèi)水解結(jié)合Ca2+[25]。但是在神經(jīng)元細胞Ca2+的調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-127顯著地改變了神經(jīng)元細去極化所誘發(fā)的Ca2+瞬變[35]。其次，由于F-127影響細胞質(zhì)膜的透性，在平滑肌單細胞加載時使用F-127，會導致在細胞質(zhì)中水解的探針釋放出細胞，對實驗結(jié)果造成干擾，所以F-127不適合用于單細胞中的Ca2+熒光成像[24, 36]。本研究結(jié)果表明，負壓輔助加載效果與F-127輔助加載的效果并無明顯差異，使用此種方法也可避免使用F-127所造成的不足。

Ca2+通道抑制劑La3+可以與Ca2+競爭抑制大量Ca2+通道，使細胞質(zhì)中游離的Ca2+減少，另外其還可以抑制植物細胞質(zhì)膜上Ca2+滲透通道來抑制Ca2+流入[37]。在La3+的影響下，花粉管生長、Ca2+通道滲透性、細胞內(nèi)Ca2+梯度和細胞外Ca2+濃度都會受到顯著影響[38]。因此，La3+常用來影響花粉萌發(fā)和花粉管正常生長。在La3+離子存在的情況下，花粉管的熒光密度和Ca2+濃度梯度都發(fā)生了顯著變化。其次，有研究認為高濃度的Cd2+會抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長[39]。Cd2+的存在減少了細胞壁可塑性和可擴展性，并損害花粉管正常的細胞伸長，導致形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變。同時，Cd2+的存在抑制了花粉管尖端Ca2+的流入，導致尖端Ca2+梯度紊亂、花粉管熒光強度降低，這與文中Cd2+的處理結(jié)果相一致[24, 40-41]。另外，花粉生長時，細胞外Ca2+流入細胞內(nèi)可以促進細胞質(zhì)游離Ca2+濃度增加，維持花粉管極性生長所需的濃度梯度[42]。在EGTA處理后，EGTA可以螯合花粉管外部Ca2+，影響花粉管的正常生長，這種細胞外Ca2+在花粉管生長中的作用機制目前仍不清楚，但對細胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、膜完整性，以及對細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡的影響都是有可能的[43-44]。使用抑制劑及螯合劑改變花粉管內(nèi)外Ca2+的濃度，花粉管中熒光密度都出現(xiàn)了相應的變化，也表明此方法具有一定可靠性。

總之，此處理方法不僅具有所需器材也較容易準備和使用方法易于掌握等優(yōu)點，而且在低溫負壓條件下加載可以保持花粉活力，促進熒光探針通過質(zhì)膜滲透進入花粉管，有效縮短探針加載時間從而避免細胞內(nèi)區(qū)室化的影響。