植物抗黃瓜花葉病毒基因研究進(jìn)展

郭廣君，王述彬，劉金兵，潘寶貴，刁衛(wèi)平，戈 偉，高長洲

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

黃瓜花葉病毒(CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，被列為世界十大植物病毒之一。黃瓜花葉病毒的寄主范圍廣，可侵染包括果樹、蔬菜和觀賞植物等100多個(gè)科的1 000多種植物[1-2]。由于世界范圍內(nèi)有些地區(qū)存在多種病毒混合侵染等情況，CMV對(duì)作物生產(chǎn)的危害程度很難進(jìn)行總體量化。根據(jù)科研人員的統(tǒng)計(jì)，在中國CMV的侵染可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)25%～50%[3]；在西班牙CMV的侵染可導(dǎo)致甜瓜減產(chǎn)60%，辣椒減產(chǎn)達(dá)80%[4-5]；在西班牙一旦番茄上出現(xiàn)CMV侵染引發(fā)的壞死，產(chǎn)量損失達(dá)到80%以上，甚至絕收[6-7]。

蚜蟲和種子帶毒是CMV傳播的主要途徑，而藥劑對(duì)病毒病的防治效果十分有限。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行抗CMV育種，具有周期短，不污染環(huán)境，抗性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)基因作物的安全問題仍受到多方質(zhì)疑[8]。利用植物自身的抗性基因?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳改良是最為經(jīng)濟(jì)和有效的遏制CMV危害的途徑[9]。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物抗黃瓜花葉病毒基因進(jìn)行了廣泛和深入研究，并取得了一定的進(jìn)展。本文就R基因介導(dǎo)的植物抗病毒病分子機(jī)制及已克隆的R基因植物抗CMV的機(jī)制和其他相關(guān)抗CMV基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為植物抗CMV基因的深入分析和應(yīng)用研究提供參考。

1 植物的天然免疫系統(tǒng)

一般認(rèn)為植物免疫系統(tǒng)由2個(gè)層面的免疫反應(yīng)組成：(1)植物通過細(xì)胞表面的跨膜識(shí)別受體識(shí)別病原物相關(guān)分子(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)所產(chǎn)生的免疫，稱為病原物相關(guān)分子激發(fā)的免疫(PAMP-triggered immunity, PTI)；(2)植物體內(nèi)的抗性基因 (Rgene)通過特異地識(shí)別病原物效應(yīng)因子所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng), 稱為效應(yīng)因子激發(fā)的免疫(Effector-triggered immunity，ETI)[10-11]。

1.1 R基因介導(dǎo)的植物抗病毒機(jī)制

R基因介導(dǎo)的抗性是指R基因直接或間接識(shí)別特定病原物的無毒基因，激活植物防御反應(yīng)。R基因介導(dǎo)的抗性可分為2種，一種稱為系統(tǒng)獲得性抗性(System acquired resistance，SAR)，主要表現(xiàn)為在病毒侵染點(diǎn)及周邊組織引起程序性細(xì)胞死亡，活性氧爆發(fā)，細(xì)胞壁加厚，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化以及大量防御基因的激活，隨后整株植物出現(xiàn)非專一性的、抗多種與起始侵染病毒相關(guān)或不相關(guān)的植物病原的抗性。在SAR過程中，病程相關(guān)(PR)基因等防衛(wèi)基因大量表達(dá)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子水楊酸、茉莉酸、乙烯、一氧化氮等在植物抗病中起重要作用[11]。R基因介導(dǎo)的第2種抗性稱之為極端抗性(Extreme resistance，ER)或細(xì)胞水平抗性(Cellular resistance)，主要表現(xiàn)為有些R基因能夠快速響應(yīng)病毒的侵入，抑制病毒的積累，將病毒的侵染限制在單細(xì)胞水平，植物表型癥狀為侵染部位僅有極小的壞死點(diǎn)[12]。典型代表為馬鈴薯Rx1基因介導(dǎo)的對(duì)馬鈴薯X病毒的抗性以及番茄Tm-22基因介導(dǎo)的對(duì)煙草花葉病毒抗性，侵染部位不出現(xiàn)肉眼可見的超敏反應(yīng)[13-14]。

1.2 植物中克隆的抗病毒R基因

目前已有多種植物病毒的抗性基因被克隆[15-16]，包括十幾個(gè)典型的NBS-LRR類病毒抗性基因，其中N基因和抗馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)基因Y-1為TIR-NBS-LRR類病毒抗性基因，其余均為CC-NBS-LRR 類病毒抗性基因(表1)。此外，還克隆了幾個(gè)不屬于NBS-LRR類病毒抗性基因

表1植物中克隆的NBS-LRR類病毒抗性基因(Rgene)及其互作的毒性基因

Table1ClonedNBS-LRRRgenesresistanttovirusandinteractionofavr-gene

病毒寄主植物抗病基因(R gene)毒性基因(Avr-gene)參考文獻(xiàn)馬鈴薯X病毒馬鈴薯Rx1、Rx2Coat protein[13]、[17]馬鈴薯Y病毒馬鈴薯Y-1-[18]辣椒 pvr1VPg[19]～[21]pvr12煙草花葉病毒番茄N-[22]、[23]Tm1Replicase[24]Tm-2230 kd movementTm-2protein菜豆矮化花葉病毒菜豆BV1Bdm[25]黃瓜花葉病毒 擬南芥RCY1Coat protein[26]cum1Vpg[27]、[28]cum2豌豆種傳花葉病毒豌豆Sbm1Vpg[29]Sbm2P3 and 6K1 cistron[30]蕪菁花葉病毒擬南芥 At-Eif(iso)4EVPg[31]甘藍(lán)型油菜 CITuRBO1,TuRBO1b,TuRBO3,TuMV P3[32]～[34]P3TuRBO4,TuRBO5番茄斑點(diǎn)枯萎病毒番茄Sw5-[35]大豆花葉病毒大豆Rsv1-[36]

家族的病毒抗性基因，包括擬南芥抗煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)基因RTM1、RTM2 和RTM3[37-38]，番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV) 抗性基因Ty-1和Ty-3，番茄抗番茄花葉病毒(Tomato mosica virus，ToMV)基因Tm-1[39]。

2 植物中R基因介導(dǎo)的對(duì)CMV的抗性

2.1 擬南芥中克隆的抗CMV的R基因及其抗性機(jī)制

擬南芥作為典型的模式植物，其CMV抗性基因克隆和機(jī)理研究最為廣泛和深入，典型代表是抗CMV的單顯性基因RCY1的研究。RCY1基因定位在5號(hào)染色體，可編碼一個(gè)相對(duì)分子量為 1.04×105的CC-NBS-LRR蛋白質(zhì)，與抗霜霉病的RPP8基因和抗蕪菁皺縮病毒的HRT基因?yàn)榈任换颍剐缘陌l(fā)揮依賴于水楊酸(SA)和乙烯(ET)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不依賴于茉莉酸(JA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SA和JA在調(diào)控RCY1功能方面存在拮抗作用，EDS5基因的表達(dá)和SA的積累在RCY1基因介導(dǎo)的抗性中發(fā)揮著重要作用[40-41]。RCY1基因表達(dá)量上調(diào)可顯著增強(qiáng)植株對(duì)CMV的抗性，抗性方式表現(xiàn)為“基因?qū)颉蹦Ｊ絒42]。RCY1通過LRR區(qū)域與CMV的致病因子CP蛋白互作誘導(dǎo)抗性[43]。擬南芥中WARKY70通過與RCY1基因編碼的CC-NBS結(jié)構(gòu)域互作，抑制CMV病毒的復(fù)制，減輕CMV的危害[44]。

擬南芥中除典型的顯性抗CMV的R基因RCY1，還克隆了2個(gè)典型的隱性抗CMV的R基因cum1和cum2，對(duì)應(yīng)的CMV病毒致病因子為Vpg蛋白質(zhì)。cum1和cum2可編碼翻譯起始因子4E(eIF4E)和4G(eIF4G)蛋白質(zhì)， eIF4E 蛋白質(zhì)可與真核 mRNA 5’ 帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，eIF4G屬于支架蛋白質(zhì)，能將 eIF4E 和起始因子結(jié)合形成 eIF4F復(fù)合體，進(jìn)而起始蛋白質(zhì)合成。突變后的 eIF4E不能和病毒移動(dòng)蛋白質(zhì)的 mRNA 結(jié)合，從而影響移動(dòng)蛋白質(zhì)的生成，限制病毒的移動(dòng)[28]。

2.2 其他植物中抗CMV的R基因及抗性機(jī)制

除擬南芥外，在其他植物主要是經(jīng)濟(jì)作物的抗CMV基因定位和克隆方面也取得了較多進(jìn)展。菜豆中同源克隆的RT4-4基因編碼一個(gè)TIR-NBS-LRR蛋白質(zhì)，與CMV的2a蛋白質(zhì)互作，引發(fā)過敏性壞死。該基因?qū)Ψ押屠苯飞戏蛛x出的7個(gè)CMV株系具有抗性，但是對(duì)菜豆上分離的CMV株系無效[45]。2009年西班牙農(nóng)業(yè)研究中心在甜瓜PI161375中鑒定出一個(gè)抗CMV基因cmv1[46]，2017年該研究中心克隆了cmv1基因，該基因可以編碼液泡分揀蛋白41，抗感材料間僅存在一個(gè)氨基酸差異(L348R)，是目前唯一與CMV在韌皮部運(yùn)輸密切相關(guān)的隱性基因[47]。韓國科研人員在C.annuumcv. bukang中鑒定的抗CMV單顯性基因Cmr1位于2號(hào)染色體的著絲粒位置，與番茄抗番茄花葉病毒的Tm-1基因和番茄抗CMV的QTL(QRCMV2)具有同位性，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Cmr1 基因抑制了CMV病毒由葉表細(xì)胞到葉肉細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[48]。中國科研人員在C.frutescenscv. PBC688的2號(hào)染色體上定位到1個(gè)抗CMV主效QTL(qCmr2.1)，預(yù)測的候選基因與擬南芥中抗CMV基因RCY1同屬NBS-LRR家族基因，同時(shí)與煙草和番茄抗煙草花葉病毒基因N的同源性高達(dá)80%以上[49]。番茄抗CMV的QTL定位中發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體上的QTLQRCMV2與番茄抗番茄花葉病毒的Tm-1基因、辣椒抗CMV的Cmr1基因具有同位性[48,50-51]；8號(hào)染色體上的QTL(QRCMV8)與馬鈴薯抗馬鈴薯 S 病毒的Ns基因具有同位性[51-52]。

3 植物中其他相關(guān)基因介導(dǎo)的對(duì)CMV的抗性

植物通過多種基因協(xié)同作用形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)抵御病毒侵害。R基因與致病因子的互作觸發(fā)防御反應(yīng)，多種基因的共同作用使植物獲得系統(tǒng)抗性。所以多方位研究相關(guān)基因的抗性機(jī)制，是對(duì)植物抗CMV分子機(jī)制研究的深入和完善。

3.1 擬南芥中其他相關(guān)基因介導(dǎo)的對(duì)CMV的抗性

擬南芥中除抗CMV的R基因外，防衛(wèi)基因、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)因子、光受體等也參與對(duì)CMV的抗性防御。① 防衛(wèi)基因：AGO1蛋白是擬南芥中RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中的核心組件，是抵抗CMV侵染的關(guān)鍵因子。CMV中2b蛋白可以阻斷AGO1的酶切活性，限制miRNA途徑，減弱RNA沉默效應(yīng)，從而達(dá)到侵染的目的[53]，擬南芥中過氧化氫酶基因CAT3與CMV的2b蛋白互作導(dǎo)致壞死斑的出現(xiàn)，CAT3基因的表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥對(duì)CMV的抗性[54]。CMV的Fny株系的2b蛋白可以調(diào)控?cái)M南芥中MircroRNA159的表達(dá)水平誘發(fā)病癥[55]。②轉(zhuǎn)錄因子：擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子HAT1在抵抗 CMV 防御反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用，其表達(dá)依賴于SA的積累[56]。③信號(hào)因子：擬南芥中NbbZIP28為CMV病毒侵染應(yīng)激的UPR信號(hào)調(diào)控因子，但不是唯一調(diào)控因子，在病毒侵染早期，可提髙寄主基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)，延緩病毒的侵染[57]。一氧化氮(NO)作為信號(hào)分子參與油菜素內(nèi)脂介導(dǎo)的擬南芥對(duì)CMV的抗性反應(yīng)[58]。④光受體：擬南芥光敏色素PHYB、向光素PHOT2基因顯著影響抗性相關(guān)基因的表達(dá)和抗氧化劑的活性，在抵抗CMV侵染中起著重要作用[59]。

3.2 其他植物抗CMV的相關(guān)基因

在煙草、油菜和莧色藜等植物中發(fā)現(xiàn)多種防衛(wèi)基因參與植物對(duì)CMV的抗性。煙草鋅指結(jié)構(gòu)蛋白Tsip1與CMV1a和CMV2a蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，抑制CMV的增殖[60]。煙草光敏色素信號(hào)通路通過調(diào)控內(nèi)源SA信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)CMV的抗性[61]。本氏煙熱激蛋白NbHsp70與CMV病毒復(fù)制酶1a相互作用，促進(jìn)CMV的復(fù)制而有利于病毒的侵染[62]。油菜中BnSGS3基因超表達(dá)可以抑制CMV的病毒積累，減輕CMV危害[63]。莧色藜CaNDR1a和CaNDR1b的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)CMV的抗性增強(qiáng)，說明該基因參與了植物對(duì)病毒的內(nèi)源免疫反應(yīng)[64]。莧色藜CaNHO1基因可編碼一種甘油激酶，其基因表達(dá)量在接種CMV后顯著上調(diào)；轉(zhuǎn)CaNHO1基因煙草可顯著延緩CMV的晚期侵染，說明該基因參與了CMV誘導(dǎo)的防御抗性[65]。矮牽牛中轉(zhuǎn)錄因子PhERF2的表達(dá)可顯著抑制CMV 外殼蛋白基因的表達(dá)水平，水楊酸和乙烯可顯著誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，說明該基因可能是通過水楊酸和乙烯信號(hào)途徑發(fā)揮作用[66]。

4 討 論

綜上所述，植物中已克隆了多個(gè)病毒抗性的R基因，為植物抗病毒病的深入分析和應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。擬南芥抗CMV基因RCY1的研究為其他作物抗CMV基因的研究提供了較好的思路。但是由于技術(shù)局限性，從RCY1基因定位到分子機(jī)理的明確，整個(gè)研究歷程超過10年。此外，由于植物對(duì)CMV的抗性大多是數(shù)量性狀，其抗性機(jī)理更加復(fù)雜，研究歷程更加漫長。例如茄果類蔬菜(主要是辣椒和番茄)，自1997年Caranta等[67]在C.annuumcv.Perennial中首次定位到3個(gè)抑制病毒入侵的QTL以來，辣椒和番茄上仍未有抗CMV相關(guān)基因的克隆，其抗性機(jī)理更是模糊不清[68-69]。因此目前植物中克隆到的抗CMV的R基因仍然十分有限，抗CMV的分子機(jī)理仍需深入研究。克隆新的抗CMV的R基因并闡明其分子機(jī)理仍然是植物抗CMV研究的重點(diǎn)，也是作物抗CMV育種的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

隨著科技的發(fā)展，技術(shù)的不斷革新，植物生物學(xué)研究方面的技術(shù)更加多樣化，效率也在不斷提高。首先，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，多種作物的基因組數(shù)據(jù)陸續(xù)公布。基于基因組數(shù)據(jù)產(chǎn)生的新基因定位技術(shù)(例如QTL-Seq、SLAF-Seq等)明顯提高了基因定位效率，基于基因組數(shù)據(jù)開發(fā)出的新一代高密度分子標(biāo)記(例如SNP和Indel等)使基因定位更為準(zhǔn)確，這些為深入研究基因功能和抗性機(jī)理奠定了很好的基礎(chǔ)[70-72]。在植物抗CMV基因定位方面，新技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛，僅從受CMV危害最為嚴(yán)重的茄科作物辣椒來看，自2014年辣椒基因組數(shù)據(jù)公布以來，利用高通量測序的方法，新定位到10個(gè)抗CMV相關(guān)QTL，相對(duì)于之前的定位研究，耗費(fèi)時(shí)間更短，定位區(qū)間更為準(zhǔn)確[73-76]。其次，CRISPR/Cas9技術(shù)引領(lǐng)了分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中顛覆性的技術(shù)革新。2013年5個(gè)獨(dú)立的研究團(tuán)隊(duì)證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在真核生物中具有功能[77-81]，最為重要的是研究證明該系統(tǒng)可以在多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯[80-81]。由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡單、高效和易操作等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9在基因功能研究和種質(zhì)創(chuàng)制上具有巨大優(yōu)勢(shì)，在多種作物上已成功應(yīng)用。例如在番茄上成功運(yùn)用該技術(shù)編輯番茄早花基因SP5G，創(chuàng)制出可提早2周開花和果實(shí)成熟的番茄材料[82]；美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室的科研人員利用該技術(shù)編輯SICLV3基因啟動(dòng)子序列創(chuàng)制出系列番茄產(chǎn)量相關(guān)性狀的突變體材料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)數(shù)量性狀更加微小的調(diào)控[83]。雖然目前還未有利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究植物抗CMV分子機(jī)理的報(bào)道，但是利用該技術(shù)進(jìn)行抗CMV分子機(jī)理研究是一種可行的思路，也是目前創(chuàng)制突變體材料及抗性種質(zhì)材料最為高效的途徑。所以充分利用多種高效的生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物抗CMV基因研究的突破，將是科研人員進(jìn)一步研究和探索的重點(diǎn)。