葡萄赤霉素合成關(guān)鍵基因VvGA20ox2的克隆、亞細(xì)胞定位和表達(dá)分析

高世敏，董 陽，王 武，陶建敏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

赤霉素作為一種植物內(nèi)源激素，在種子的萌發(fā)，莖和根的伸長，葉片伸展，花和果實(shí)的發(fā)育等植物生長的整個生命周期起著重要的調(diào)控作用[1-7]。目前關(guān)于赤霉素生物合成路徑的研究已趨于完善[8-11]，此過程需要多種酶參與完成，包括參與 GA 合成早期步驟的一些酶,如古巴焦磷酸合成酶(CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(KO)和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(KAO)及參與后期步驟的一些酶，如GA20-氧化酶(GA20ox)、GA3β羥基化酶(GA3ox) 和GA2-氧化酶(GA2ox)，其中，CPS、GA20ox和GA3ox被認(rèn)為是整個赤霉素的生物合成過程中起關(guān)鍵作用的酶，GA20ox的主要作用是通過多步反應(yīng)將 GA12和GA53催化合成 GA9和 GA20，從而形成有生物活性的GAs[12-13]。

葡萄是世界上廣泛種植的果樹之一，中國的鮮食葡萄產(chǎn)量占全球葡萄產(chǎn)量的 14%[14]，金手指葡萄(Golden Finger，V.viniferaL. ×V.larbruscaL.)為鮮食葡萄的一種，甘甜爽口，有濃郁的冰糖味和牛奶味，且果粒形狀奇特美觀，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于自然環(huán)境及自身生長因素的影響，在成熟時葡萄果粒往往形態(tài)大小不一致，造成商品質(zhì)量下降。為了更加有效地提高生產(chǎn)質(zhì)量，開展葡萄果實(shí)形狀的研究變得尤為重要。傳統(tǒng)的改良果實(shí)形狀的育種方法主要是雜交實(shí)生選種，這需要較長的時間和較大的種植規(guī)模[15]。目前生產(chǎn)上多使用植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育，改善果實(shí)品質(zhì)，外源赤霉素(GA3)作為一種重要的生長調(diào)節(jié)劑，在果實(shí)的發(fā)育及膨大方面起著重要作用，可調(diào)節(jié)果實(shí)形狀[16-18]。有研究結(jié)果表明外源GA3處理對葡萄的果形指數(shù)影響較大，鄭煥等[17]發(fā)現(xiàn)鐘山紅葡萄果形指數(shù)隨著盛花期使用GA3濃度的增加而增大，當(dāng)濃度達(dá)到一定值后，果形指數(shù)并無顯著提高。但赤霉素調(diào)節(jié)葡萄果實(shí)形狀的分子機(jī)制仍不清楚，GA20ox作為赤霉素合成過程中的關(guān)鍵酶，可能調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育，影響葡萄果形變化。染色質(zhì)免疫共沉淀表明AtGA20ox1基因作為AtOFP1的靶基因調(diào)控著果實(shí)的發(fā)育，AtOFP1轉(zhuǎn)錄因子通過抑制AtGA20ox1的表達(dá)，從而抑制下胚軸細(xì)胞的生長，產(chǎn)生矮小的植株表型，過量表達(dá)AtOFP1的擬南芥角果縱徑變短[19]。目前在葡萄中關(guān)于GA20ox2基因的研究主要集中在GA20ox在赤霉素合成過程中的調(diào)控，因此探討GA20ox2基因在葡萄果實(shí)形狀上的作用具有重要的實(shí)際意義和參考價值。

針對金手指葡萄果形的特異性，掌握合適的GA3處理時間及濃度對果實(shí)的生長及形狀的一致性尤為關(guān)鍵，本試驗(yàn)以金手指葡萄盛花后7 d的幼果為材料，克隆出VvGA20ox2基因，對其進(jìn)行序列特征及表達(dá)分析，以期從分子水平上初步了解赤霉素調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育機(jī)理，為葡萄果形方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年5月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄試驗(yàn)基地進(jìn)行。供試品種為5年生金手指葡萄，采用平棚架避雨栽培，株行距為 3.0 m×6.0 m, T型架，常規(guī)田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間處理 選取3株長勢一致的金手指葡萄樹，為了增強(qiáng)試驗(yàn)的可靠性，在處理前統(tǒng)一修剪花序，序尖留約4 cm，試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，在每株樹的兩臂分別為處理組和對照組。以每個花序一半以上的小花開放時期作為盛花期，在盛花后7 d，用質(zhì)量濃度為25 mg/L的赤霉素溶液對幼果進(jìn)行浸泡處理，處理時間大約為10 s，以清水處理作為對照(CK)。

1.2.2 樣品采集 分別采集處理后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 5個時期的對照組及處理組葡萄果實(shí)樣品，從3 次生物學(xué)重復(fù)的植株上隨機(jī)采集，取樣時兼顧陰陽兩面，用液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱中待用。果實(shí)成熟時，在處理組和對照組中各選取30粒果粒用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，測量其縱橫徑。

1.2.3 RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 采用多糖多酚植物組織總RNA提取試劑盒(成都福際公司產(chǎn)品)提取上述各時期樣品的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一條鏈，稀釋后的 cDNA 用于實(shí)時熒光定量 PCR。

1.2.4VvGA20ox2基因ORF的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)已知RNA-seq測序結(jié)果，在NCBI中查找到GA20ox2在葡萄中的預(yù)測序列(XP_002266536.1)，其CDS區(qū)在GenBank的登錄號為KC898186，利用DNAMAN 8.0設(shè)計特異性引物M1(表1)，以盛花后7 d果實(shí) cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25.0 μl)為：稀釋后的cDNA 1.0 μl，5×PrimeSTAR GXL buffer 5.0 μl，dNTP mixture 2.0 μl，PrimeSTAR GXL DNA polymcrace 0.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，滅菌后ddH2O 15.5 μl；反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測后用 DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，并連接到pEASY-Blunt載體(全式金)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆鑒定后由擎科公司進(jìn)行測序。

利用BioXM和 Prot-Param 在線軟件對VvGA20ox2基因編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

引物名稱 上游引物(5'→3') 下游引物(5'→3')M1ATGGACTCGAGTGCCTCAACTTATTTGGTTTGAGAT-GAGAGAGACGM2GCTTATTGTCAGAGAAGGCTGGAGAGTATCATTATTGGM3CTGCCCTTTCGAAAGATCCCATAACGTCATGCATTACATGactinTACAATTCCATCATGAAGTGT-GATGTTAGAAGCACTTCCTGTGAA-CAATG

1.2.5VvGA20ox2基因的亞細(xì)胞定位 通過Gateway系統(tǒng)，構(gòu)建PMDC43-GFP/VvGA20ox2表達(dá)載體。首先將已鑒定測序正確的VvGA20ox2基因連接到入門級載體pDONR221，然后使用BsrGI將其單酶切線性化，通過同源重組與PMDC43 載體進(jìn)行連接，從而完成PMDC43-GFP/VvGA20ox2瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建，最后將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR 擴(kuò)增(引物M3見表1)篩選陽性克隆，并對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后，進(jìn)行煙草瞬時侵染試驗(yàn)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組載體的煙草瞬時轉(zhuǎn)化及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位的方法參考已有報道[20]進(jìn)行。

1.2.6VvGA20ox2基因的表達(dá)分析 根據(jù)VvGA20ox2基因堿基序列設(shè)計實(shí)時熒光定量 PCR 特異引物M2(表 1)，以葡萄Actin(XM_002265440)作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系(20.0 μl)為： cDNA 1.2 μl，2×SYBR PremixExTaqTM (TaKaRa公司)10.0 μl，上、下游引物各 0.4 μl，滅菌后ddH2O補(bǔ)足至20.0 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，采用ABI7300system 軟件和 2-△△Ct[21]方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 果實(shí)縱、橫徑的測量及果形指數(shù)的計算 果實(shí)成熟后，每個處理各取30個有代表性的果粒，用電子游標(biāo)卡尺測量其縱、橫徑，計算果形指數(shù)。數(shù)據(jù)采用SAS 9.1軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄VvGA20ox2基因的克隆

根據(jù)先前RNA-seq研究結(jié)果中選擇差異表達(dá)基因GA20ox2，在NCBI中獲得此基因的預(yù)測序列。以盛花后14 d金手指葡萄幼果為材料，擴(kuò)增出一條1 000 bp左右的片段(圖1)。測序并通過DNAMAN軟件將得到的序列與預(yù)測序列(XP_002266536.1)進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，CDS序列長度一致，長度為1 134 bp。第547位核苷酸發(fā)生突變，由TGG變成AGG，其編碼氨基酸由色氨酸變成精氨酸(圖2)。

M：DL2000 market；1：VvGA20ox2基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 VvGA20ox2基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of VvGA20ox2 gene

方框內(nèi)為突變位點(diǎn)。圖2 VvGA20ox2基因ORF及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The open reading frame of VvGA20ox2 and the sequence of deduced amino acid

2.2 葡萄VvGA20ox2蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 VvGA20ox2蛋白的理化性質(zhì)分析VvGA20ox基因編碼377個氨基酸，包含51個酸性氨基酸(Asp+Glu)，49個堿性氨基酸(Arg+Lys)，編碼產(chǎn)物相對分子量為42 788.605，等電點(diǎn)為6.93，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)是32.8，平均親水系數(shù)為-0.649，屬于親水蛋白質(zhì)。

2.2.2 VvGA20ox2蛋白的疏水性、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析 疏水性分析結(jié)果表明，VvGA20ox2蛋白沒有明顯的疏水性區(qū)域，屬于親水蛋白。 TMHMM Servecr v.2.0分析結(jié)果表明，VvGA20ox2蛋白沒有跨膜區(qū)域。利用SignalP4.0軟件預(yù)測信號肽，結(jié)果表明VvGA20ox2蛋白沒有信號肽。

2.2.3 VvGA20ox2蛋白的二級結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋預(yù)測 VvGA20ox2蛋白包含32.10%的α-螺旋(Alpha helix)，21.49%的β-折疊(Extended strand)，10.61%β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和35.81%的無規(guī)則卷曲(Random coil)，利用在線網(wǎng)站Net NES1.1預(yù)測VvGA20ox2蛋白的NES，結(jié)果表明VvGA20ox2蛋白僅有4個NES保守位點(diǎn)，分別是亮氨酸(197，202)，異亮氨酸(199，205)。

2.2.4 VvGA20ox2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹 在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中查找葡萄VvGA20ox2蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)第59～171氨基酸位點(diǎn)為DIOX_N結(jié)構(gòu)域，第221～320位點(diǎn)是2OG-Fell_Oxy結(jié)構(gòu)域。

將VvGA20ox2蛋白氨基酸序列與其他物種的同源氨基酸序列進(jìn)行比對(圖3)，試驗(yàn)結(jié)果表明，所有氨基酸序列均含有上述兩個結(jié)構(gòu)域，說明GA20ox蛋白在各個物種中是相對保守的，通過同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)VvGA20ox2基因編碼的氨基酸序列與多種植物GA20ox氨基酸序列相似性在51%～67%，其中，與可可(EOX92603.1)和楊樹(PNT28192.1)的同源性較高，分別達(dá)到65%和67%，與草莓(ABB00359.1)、番茄(NP_001234070.1)、擬南芥(AGW24332.1)、水稻(AER45797.1)、玉米(AQK99102.1)、煙草(XP_016471245.1)的同源性分別為53%、55%、53%、55%、54%、56%，而與小麥(CFV04355.1)的同源性為51%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明(圖4)，葡萄VvGA20ox2蛋白與可可和楊樹親緣關(guān)系較近，與模式植物擬南芥、番茄等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹與物種進(jìn)化關(guān)系一致。

黑色方框代表DIOX_N結(jié)構(gòu)域，紅色方框代表2OG-Fell_Oxy結(jié)構(gòu)域。圖3 葡萄VvGA20ox2與其他植物GA20ox蛋白氨基酸序列的同源性比對Fig.3 Multiple sequence alignment of the VvGA20ox2 and GA20ox from other plants

圖4 葡萄VvGA20ox2與其他物種GA20ox蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of VvGA20ox2 in grapevine and the GA20ox protein amino acid sequence in other species

2.3 VvGA20ox2蛋白亞細(xì)胞定位

為探索VvGA20ox2基因所編碼蛋白在植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布情況，進(jìn)一步構(gòu)建了VvGA20ox2的瞬時表達(dá)載體35S-VvGA20ox2-GFP，并將其轉(zhuǎn)化到煙草細(xì)胞內(nèi)，借助綠色熒光蛋白來確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞，在侵染后將煙草暗培養(yǎng)3 d后，制作臨時切片，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。結(jié)果顯示，PMDC43-GFP空載體在整個細(xì)胞范圍內(nèi)都顯示出綠色熒光信號(圖5)，而瞬時表達(dá)載體35S-VvGA20ox2-GFP表達(dá)的融合蛋白不僅在細(xì)胞核上有熒光信號，在細(xì)胞膜上也可觀察到綠色熒光(圖5)。

圖5 VvGA20ox2在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of VvGA20ox2 in tobacco epidermal cells

2.4 VvGA20ox2 基因在GA3處理后表達(dá)分析

GA3處理后不同時期金手指葡萄果實(shí)VvGA20ox2基因表達(dá)實(shí)時熒光定量分析結(jié)果顯示(圖6)，在GA3處理后第1 d，VvGA20ox2基因處理組的VvGA20ox2基因表達(dá)量顯著低于對照，呈現(xiàn)顯著下降趨勢。隨后在GA3處理后第2 d,處理組VvGA20ox2基因表達(dá)急速上升，在第3 d時相對表達(dá)量達(dá)到最高。在GA3處理后第7 d，此基因表達(dá)水平與對照相比差異較小，在GA3處理后第14 d幾乎檢測不到該基因的表達(dá)。

圖6 VvGA20ox2 基因在赤霉素處理的金手指葡萄果實(shí)中不同時期的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of VvGA20ox2 gene of Gold Finger grape treated by gibberellin at different development stages

2.5 果?？v、橫徑及果形指數(shù)

葡萄果?？v徑在赤霉素處理下相比對照均有增長，且差異極顯著(表2)。GA3處理下葡萄果粒橫徑增大，相比對照差異不顯著，25 mg/L赤霉素處理后果形指數(shù)與對照差異極顯著，說明葡萄果形發(fā)生顯著變化。

表2赤霉素處理對果粒形狀的影響

Table2Effectofgibberellintreatmentonfruitshape

同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

在赤霉素生物合成途徑中，參與GA合成早期步驟的一些酶由單基因編碼，而參與后期步驟的一些酶則由多基因家族編碼。目前，許多赤霉素合成代謝中的關(guān)鍵基因在葡萄上已經(jīng)被克隆并進(jìn)行了研究[22-24]，GA20ox家族基因是植物體內(nèi)合成活性赤霉素的關(guān)鍵基因，在活性赤霉素的合成過程起著極其重要的作用。在葡萄中關(guān)于GA20ox2基因的研究多集中于對赤霉素合成的調(diào)控，主要研究赤霉素處理葡萄在不同花期VvGA20ox3表達(dá)的變化[25]。改變基質(zhì)濃度研究GA20ox2對其基因調(diào)控產(chǎn)物 GA12合成的影響[26]，及在不同品種中的GA20ox家族的組織特異性表達(dá)差異[27]，并未深入探討GA20ox2基因在赤霉素調(diào)控合成中的作用對果實(shí)形狀的影響。本試驗(yàn)通過對金手指葡萄果形轉(zhuǎn)錄組的分析，找到差異表達(dá)基因VvGA20ox2，并在金手指葡萄中克隆出VvGA20ox2基因，與NCBI中預(yù)測基因相比，該基因發(fā)生點(diǎn)突變，但突變位點(diǎn)不在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這可能是由于測序品種和試驗(yàn)品種不同造成的。多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，在葡萄、楊樹、番茄、擬南芥、水稻、煙草、可可、小麥、草莓和玉米等 10 種植物中，VvGA20ox2基因與楊樹同源基因親緣關(guān)系最近，并且在10種植物中具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，說明GA20ox2基因功能是相對保守的。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞瞬時表達(dá)結(jié)果顯示，VvGA20ox2蛋白同時定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中，說明此基因編碼的產(chǎn)物不僅在細(xì)胞核上有功能，而且在細(xì)胞膜上起作用。由于膜上的蛋白質(zhì)主要有載體蛋白、與細(xì)胞活動相關(guān)的離子泵、通道蛋白和蛋白受體等，因此VvGA20ox2的編碼產(chǎn)物對細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定或控制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定的作用[28]。與VvGA20ox1蛋白定位結(jié)果一致[22]，推測可能發(fā)揮相似的功能。

利用外源GA對花序和幼果處理可有效地提高果實(shí)品質(zhì)，促進(jìn)果實(shí)發(fā)育及膨大，在許多果樹生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)采用外施GA3處理葡萄幼果，在果實(shí)成熟時，處理后的果實(shí)縱徑顯著增長，與對照相比，果形發(fā)生明顯變化。為了進(jìn)一步了解VvGA20ox2基因在調(diào)節(jié)葡萄果形方面的功能，試驗(yàn)利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對該基因在處理與對照樣品間的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，在GA3處理后1 d內(nèi)，VvGA20ox2的表達(dá)受到抑制，其原因可能在于GA20ox2基因的轉(zhuǎn)錄水平受到GAs初期的反饋調(diào)節(jié)影響。由于施用了外源 GA 使得果實(shí)內(nèi) GA 含量增高，進(jìn)而抑制了該基因的表達(dá)，這與 GA 應(yīng)答系統(tǒng)與活性 GA 含量之間存在著前饋和反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系相一致，在GA3處理1 d后表達(dá)量迅速升高，并在第3 d達(dá)到峰值。在擬南芥中，AtGA20ox1 和AtGA20ox2基因可以促進(jìn)下胚軸生長及角果的伸長[29]，推測AtGA20ox同源基因VvGA20ox2可能參與了葡萄果形拉長的調(diào)控，從而促進(jìn)果實(shí)的增長，產(chǎn)生長形果實(shí)。在GA3處理后第7 d，基因的表達(dá)逐漸下降，在第14 d幾乎沒有表達(dá)，可能與赤霉素的作用減弱有關(guān)。有研究結(jié)果表明，外源GA3的作用效果可以持續(xù)7～15 d[30]。

關(guān)于GA3對葡萄果實(shí)形狀的調(diào)控作用，研究仍未深入，從擬南芥果形相關(guān)的研究中可知，AtGA20ox1基因作為AtOFP1的靶基因調(diào)控著果實(shí)的發(fā)育，影響植株大小。本試驗(yàn)從葡萄活性赤霉素合成中關(guān)鍵活性基因的序列功能及表達(dá)進(jìn)行了分析，通過GA3處理后GA20ox2基因在幼果中的表達(dá)變化，調(diào)節(jié)內(nèi)源赤霉素含量，從而影響果實(shí)發(fā)育，控制果形變化。同時，推測GA20ox2基因可能作為控制果形OVATE基因的靶基因調(diào)控果實(shí)發(fā)育，影響果實(shí)形狀，但具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚，需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證兩者的關(guān)系，關(guān)于GA20ox2基因的在果形上的功能需要通過基因沉默和超表達(dá)進(jìn)一步研究。