血小板及其膜仿生學(xué)在動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用進(jìn)展

李琦玉，張 寧，陳 婧，黃浙勇

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所，上海 200032

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)在全球范圍內(nèi)仍是心血管疾病最常見最重要的病因，而血小板在動(dòng)脈粥樣硬化的多個(gè)發(fā)展階段中發(fā)揮了重要作用。血小板是一種直徑在1～3 μm的小的、盤狀的、無核的血細(xì)胞，來源于骨髓中的巨核細(xì)胞[1]，通常負(fù)責(zé)維持體內(nèi)的止血功能[2]。靜息血小板在血液中循環(huán)維持血管完整性，但在內(nèi)皮功能障礙時(shí)可迅速激活，隨后黏附于受損血管處[3]。血小板還可以與炎癥細(xì)胞結(jié)合，起到募集炎癥細(xì)胞聚集到炎癥內(nèi)皮處的作用，并強(qiáng)有力地黏附于內(nèi)皮下基質(zhì)[4]。斑塊破裂后會(huì)誘發(fā)血小板放大聚集反應(yīng)，在病理?xiàng)l件下，血小板大量聚集會(huì)引發(fā)致命性血栓形成，導(dǎo)致心肌梗死[5]。而血小板的這種功能多樣性主要來源于其獨(dú)特的表面成分，主要負(fù)責(zé)免疫逃逸、內(nèi)皮下黏附、病原體相互作用[6]。其中，血小板抵達(dá)受損血管是通過膠原受體α2β1和糖蛋白受體GPⅥ、Ⅰb-Ⅴ-Ⅸ和vWF受體等黏附內(nèi)皮下基質(zhì)[7]。所以根據(jù)血小板的諸多特性，可以直接利用血小板搭載藥物，或利用血小板膜的特性與納米顆粒結(jié)合，提高納米顆粒的循環(huán)周期和靶向運(yùn)送效率。典型的納米顆粒(nanoparticle，NP)直徑通常在1～100 nm，可以由有機(jī)材料如脂質(zhì)、金屬、無機(jī)材料或上述材料混合而成[8]。NP可以包裹藥物等運(yùn)送到人體的靶點(diǎn)，是一種更安全、更有效的藥物遞送方式，而細(xì)胞膜-納米顆粒在藥物運(yùn)送、疫苗和解毒方面也不斷發(fā)展[9]。本文將著重介紹血小板在藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用，血小板膜仿生學(xué)和納米顆粒結(jié)合的發(fā)展以及這些技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用前景。

1 血小板載體

NP的大小、形狀、表面電荷、穩(wěn)定性和其他各種特性都可以被調(diào)整，以最大程度發(fā)揮其在體內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)，但是水溶性低、生物利用度差、代謝快、特異性有限和不良反應(yīng)等限制仍需改善[10]。與NP相比，循環(huán)細(xì)胞有許多優(yōu)點(diǎn)。它們具有高度的生物相容性和可移動(dòng)性，具有較長(zhǎng)的循環(huán)壽命，生物可降解性，天然的靶向細(xì)胞/組織，具有較高的載藥能力，在循環(huán)中非常穩(wěn)定，能夠跨越生物屏障[11]。各種類型的細(xì)胞被研究用于藥物遞送系統(tǒng)，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、干細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板[12]。血小板載體因其在凝血止血、機(jī)體固有免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的關(guān)鍵作用而受到越來越多的關(guān)注。此外，血小板的循環(huán)壽命僅為8～10 d，這種快速的循環(huán)時(shí)間可以避免不必要的體內(nèi)積累，負(fù)載的藥物可在血小板活化時(shí)自然釋放[13]。Xu等[14]利用天然血小板負(fù)載阿霉素(doxorubicin，DOX)治療淋巴瘤并降低了DOX的心臟毒性，血小板負(fù)荷DOX還具有高載藥量、高包封效率的特點(diǎn)。但由于血小板在血栓形成和腫瘤發(fā)展中的負(fù)面作用，全血小板產(chǎn)品有限的保質(zhì)期來維持其生物功能，意想不到的血小板活化的發(fā)生等，會(huì)顯著影響治療穩(wěn)定性[15]。因此，天然的血小板負(fù)荷抗AS藥物可能仍待商討，或者簡(jiǎn)單地用血小板膜進(jìn)行工程處理是解決上述問題的一種方法。

2 血小板模擬運(yùn)送系統(tǒng)

血小板的作用主要是通過其膜表面蛋白實(shí)現(xiàn)的，所以研究者利用納米技術(shù)和生物結(jié)構(gòu)(如功能肽、模擬細(xì)胞膜受體或整個(gè)細(xì)胞膜本身)來設(shè)計(jì)仿生NP，以更好地實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)送藥物的可能。Kona等[16]將GPⅠb偶聯(lián)到NP上以模擬血小板黏附損傷動(dòng)脈壁，以提高NP在流體剪切力作用下對(duì)炎癥內(nèi)皮細(xì)胞和損傷動(dòng)脈壁的黏附和靶向性。GPⅠb偶聯(lián)的NP可以控制負(fù)載藥物在血管受損處的釋放，這對(duì)于AS的治療是具有應(yīng)用價(jià)值的，但是該修飾顆粒是否會(huì)和血小板發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)有待進(jìn)一步研究。此外，血小板會(huì)與活化的單核細(xì)胞相互作用靶向到梗死區(qū)域，所以Cheng等[17]收集血小板膜蛋白組，整合到脂質(zhì)體膜上以制備類血小板蛋白脂質(zhì)體(platelet-like proteoliposome，PLP)。與不經(jīng)血小板膜蛋白修飾的脂質(zhì)體相比，PLP能夠特異性結(jié)合單核細(xì)胞，靶向損傷組織而非內(nèi)皮細(xì)胞。Anselmo等[18]用膠原結(jié)合肽、vWF結(jié)合肽和線性纖維蛋白原模擬肽修飾血小板樣納米顆粒來靶向血管損傷部位。血小板模擬運(yùn)送系統(tǒng)為設(shè)計(jì)具有良好生物相容性的仿生顆粒提供了一種新的策略，且利用血小板通過表面膜蛋白聚集到受損血管處的性質(zhì)為抗AS的治療提供新的可能。

3 血小板膜包裹納米顆粒(platelet membrane-cloaked nanoparticles，PNP)

PNP是血小板膜和100 nm的聚乳酸-羥基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]納米顆粒融合而成，所得的PNP尺寸約比裸露的NP大15 nm，但具有與血小板和血小板膜源囊泡相同的表面電荷[19]。與未包裹的NP相比，PNP減少了巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)NP的攝取，且沒有誘導(dǎo)補(bǔ)體活化[20]，循環(huán)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，半衰期超過24 h[21]。這種PNP保留了類似血小板的特性，如選擇性地黏附于受損血管[22]。由于外表面有大量帶負(fù)電荷的唾液酸分子，血小板膜的外表面和內(nèi)表面之間存在著電荷分布的差異。Hu等[19-23]使他們的納米顆粒帶負(fù)電荷。因此，通過與血小板外膜的靜電排斥，納米顆粒優(yōu)先與內(nèi)膜結(jié)合，保證外膜的受體在體內(nèi)發(fā)揮作用。

實(shí)現(xiàn)模擬受體結(jié)合納米顆粒所需要的復(fù)雜化學(xué)修飾可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，且結(jié)合一種或幾種蛋白質(zhì)并不能完全模擬血小板的生物功能[24]。因此研究者利用細(xì)胞膜包裹納米顆粒來構(gòu)建仿生納米材料。Hu等[19]開發(fā)了血小板膜包裹納米顆粒，并首先證實(shí)了血小板膜蛋白的完整性。Dehaini等[25]成功制備了一種結(jié)合了兩種不同細(xì)胞類型功能的新型細(xì)胞膜包裹納米顆粒，其保留了血小板膜和紅細(xì)胞膜各自的特性，而紅細(xì)胞膜可以顯著延長(zhǎng)循環(huán)周期。Wei等[26]發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中注射PNP可以靶向抵達(dá)AS斑塊區(qū)域和有發(fā)生斑塊傾向的區(qū)域，這給靶向治療動(dòng)脈粥樣硬化和早期發(fā)現(xiàn)AS帶來了可能性；又利用Gd修飾的PNP，作為MRI的造影劑，在注射1 h后，發(fā)現(xiàn)斑塊區(qū)和潛在的AS處都有顯著的信號(hào)。Song等[27]給apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-)小鼠模型注射PNP，其運(yùn)載的雷帕霉素可以有效靶向AS斑塊，延緩AS進(jìn)展，穩(wěn)定AS斑塊。PNP作為藥物遞送系統(tǒng)，可以在減少藥物的系統(tǒng)毒性和延長(zhǎng)循環(huán)周期的同時(shí)，靶向運(yùn)送該藥物到斑塊處，這在AS的治療上發(fā)揮了重要作用。

4 應(yīng)用與展望

當(dāng)血小板黏附在血管損傷部位并被激活時(shí)，血小板會(huì)瞬間產(chǎn)生肌動(dòng)球蛋白介導(dǎo)的肌肉樣收縮，這種收縮會(huì)顯著降低血栓的總體大小，同時(shí)這種激活依賴的收縮反應(yīng)可以用于控制藥物的釋放[28-29]。Hansen等[30]因此構(gòu)建了聚電解質(zhì)多層(polyelectrolyte multilayer，PEM)膠囊，其外表面含有纖維蛋白原，進(jìn)入體內(nèi)后與αⅡbβ3結(jié)合并形成血小板-雜交PEMs。然后利用血小板收縮力，在血管受損處裂解釋放載荷Ⅷ因子止血。這種利用血小板收縮力和血流剪切力的納米材料同樣可以運(yùn)用到AS的治療中，相比于膜包裹的納米顆?？梢栽诎邢蜻\(yùn)送藥物的同時(shí)快速實(shí)現(xiàn)藥物釋放。

血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)是從活化的血小板上脫落下來的直徑0.1～1 μm的磷脂雙分子層碎片，表面的整合素GPⅡb-Ⅲa和P-選擇素片段促進(jìn)了與纖維蛋白原、纖維蛋白、活化血小板和白細(xì)胞的結(jié)合[31-32]。Pawlowski等[33]利用PMPs的性質(zhì)設(shè)計(jì)了脂質(zhì)體納米顆粒，模仿PMPs的多價(jià)配體受體作用，擯棄了其促血栓促炎等不良反應(yīng)，靶向運(yùn)送溶栓藥物到AS所致血栓處。

血小板膜的應(yīng)用主要是最近幾年興起的，在證實(shí)了血小板膜的生物特性后發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域的價(jià)值。血小板由于天然的生理性質(zhì)可以直接作為藥物載體，但也正是因?yàn)槠涔δ芏鄻有院筒灰妆４娴忍攸c(diǎn)，某種程度限制了其應(yīng)用。而生物工程利用其細(xì)胞膜表面蛋白的性質(zhì)，模仿血小板表面膜蛋白修飾納米顆粒，或血小板膜包裹納米顆?？梢酝暾乇Ａ裟さ鞍?，或利用受體配體作用結(jié)合體內(nèi)血小板，又或是利用血小板分泌的微粒的特性設(shè)計(jì)納米顆粒等，這些生物工程的應(yīng)用，給靶向遞送藥物到AS所致血管損傷和血栓處帶來了極大的應(yīng)用價(jià)值。盡管如此，這些生物材料的安全性和有效性還需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。