外泌體在心肌細(xì)胞肥大中的作用

秦磊 王占黎 于慧

014040 包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院(秦磊)；014040 包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(王占黎、于慧)

外泌體通過(guò)攜帶蛋白質(zhì)、DNA以及微小RNA(microRNA)等介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)與信息交換。心血管疾病是全人類發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在多種心血管疾病的診斷和治療中發(fā)揮著重要的作用，而心肌細(xì)胞肥大是心力衰竭等獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[2]。本文對(duì)近年來(lái)外泌體在心肌細(xì)胞肥大中發(fā)揮的作用進(jìn)行總結(jié)。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生物起源

1983年，Pan等[3]和Johnstone等[4]在綿羊的成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了一種非常小的囊泡，并在1987年將這種由細(xì)胞分泌的微小囊泡命名為外泌體?，F(xiàn)在，外泌體被定義為起源于多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，直徑在50～100 nm的納米膜囊泡。它們本質(zhì)上是核內(nèi)MVBs與細(xì)胞膜融合時(shí)產(chǎn)生的包裹在單層膜中的多個(gè)腔內(nèi)小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)。外泌體的釋放可以由多種刺激引起，包括細(xì)胞氧化、衰老、分化、激活、轉(zhuǎn)化及病毒感染。MVBs產(chǎn)生ILVs的過(guò)程以及它們?cè)鯓优c細(xì)胞膜融合尚不完全清楚。目前，主要發(fā)現(xiàn)兩種途徑。第一種途徑與轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)密切相關(guān)。ESCRT包含0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ四個(gè)分型，并且均被釋放ILVs的內(nèi)吞體膜吸收。在ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ識(shí)別泛素化蛋白，ESCRT Ⅰ、Ⅱ誘導(dǎo)及其他因素的共同作用下晚期內(nèi)吞體膜內(nèi)陷，隨后ESCRT Ⅲ限制了ESCRT Ⅱ的功能使貨物蛋白去泛素化，導(dǎo)致晚期內(nèi)吞體大量聚集并脫落，最終形成 ILVs[5]。在ESCRT被完全消耗的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生MVBs，因此神經(jīng)酰胺途徑被提出，該途徑依靠?jī)?nèi)吞體膜的特定脂質(zhì)成分獨(dú)立存在，內(nèi)吞體腔體膜上的脂筏含有大量鞘脂，中性鞘磷脂酶2可以將鞘脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺，大量的神經(jīng)酰胺聚合使MVBs膜性結(jié)構(gòu)域相接合，導(dǎo)致ILVs出芽[6]?？傊?，ILVs在MVBs中的形成是外泌體生物起源的開(kāi)始，主要在ESCRT途徑和神經(jīng)酰胺途徑的作用下完成。

1.2 外泌體的結(jié)構(gòu)組成和生物學(xué)特性

外泌體是直徑在50～100 nm，密度在1.10～1.14 g/ml脂質(zhì)雙層膜結(jié)合囊泡，幾乎存在于所有的生物液體中，負(fù)染后在透射電鏡下呈圓球狀或杯狀。有研究表明，外泌體在電鏡下的形態(tài)與提取方法有關(guān)。外泌體內(nèi)裝載的貨物包括蛋白質(zhì)，脂類衍生物、DNA、mRNAs、microRNAs以及其他非編碼RNAs。脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是外泌體膜的主要成分，目前外泌體中典型的蛋白質(zhì)包括四分子交聯(lián)體家族成員(CD9、CD63、CD81、CD82)、抗原提呈蛋白(MHC Ⅰ和Ⅱ)、MVBs形成蛋白(Alix、TSG101)。一些蛋白質(zhì)會(huì)被外泌體優(yōu)先選擇，但這一過(guò)程是如何產(chǎn)生的還是未知。目前的研究希望通過(guò)改善外泌體的分離方法、提高蛋白質(zhì)的純度及檢測(cè)方法使得對(duì)外泌體蛋白質(zhì)組的鑒別更加精確[7]。在外泌體循環(huán)的過(guò)程中，外泌體源性RNA被相鄰或者遠(yuǎn)距離的細(xì)胞吸收后對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，其中mRNAs被翻譯成蛋白質(zhì)而microRNAs沉默靶基因，這一現(xiàn)象在免疫應(yīng)答、癌癥、心血管疾病等多個(gè)領(lǐng)域被發(fā)現(xiàn)。

2 microRNA在外泌體中的裝載及臨床應(yīng)用

microRNAs是由17～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶mRNA的3’UTR參與靶基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[8]。單個(gè)microRNA可能調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)基因，占轉(zhuǎn)錄總量的50%～60%，表明microRNA具有生物學(xué)多向性[9]。外泌體攜帶重要的microRNA并可通過(guò)microRNA直接調(diào)控基因表達(dá)，將信息傳遞給靶細(xì)胞，在靶細(xì)胞中積極促進(jìn)基因表達(dá)的變化，并對(duì)所受壓力做出反應(yīng)。Valadi等[10]認(rèn)為，特定的microRNA序列被定向包裝到外泌體內(nèi)，并且通過(guò)微陣列分析表明這些microRNA序列不是隨機(jī)產(chǎn)生的。目前，microRNA在外泌體中的裝載機(jī)制主要包括以下四種：(1)在富含microRNA的外泌體中發(fā)現(xiàn)一種含有四個(gè)核苷酸的序列(GGAG)，該序列與異構(gòu)核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)相互作用參與microRNA的裝載；(2)microRNA在轉(zhuǎn)錄修飾后以3端尿苷化的形式存在，似乎有助于直接將microRNA轉(zhuǎn)入外泌體；(3)中性鞘磷脂酶2在參與ILVs出芽的同時(shí)，其過(guò)表達(dá)增加細(xì)胞外microRNA的含量；(4)AGO 2是一種與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體相關(guān)的蛋白質(zhì)，參與RNA沉默并且被認(rèn)為在控制microRNA進(jìn)入外泌體時(shí)發(fā)揮了重要作用，敲除AGO 2可以減少外泌體中特定microRNAs的數(shù)量[11]。外泌體microRNAs能夠穩(wěn)定地存在于血液、唾液、尿液等多種體液中，其含量和組成在健康人和患者中存在差異，因此外泌體microRNA可作為非侵入性生物標(biāo)記物來(lái)表示疾病的狀態(tài)。新技術(shù)可以從體液中分離純度較高的外泌體，為疾病的診斷和治療檢測(cè)制定更精準(zhǔn)、更微創(chuàng)的方案。

3 心肌肥大的發(fā)生機(jī)制及分類

3.1 心肌肥大的發(fā)生機(jī)制

心肌肥大與多個(gè)信號(hào)通路被激活密切相關(guān)，包括鈣離子及其相關(guān)的信號(hào)通路，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路等。機(jī)械性張力也是心肌肥大的重要因素之一，其在刺激心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)促使心肌細(xì)胞生成并分泌血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)、胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ、兒茶酚胺、內(nèi)皮素以及一氧化氮[12]。血管緊張素Ⅱ在血管平滑肌內(nèi)與ATR1結(jié)合，通過(guò)Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶途徑使血管平滑肌收縮，導(dǎo)致血壓升高和心臟負(fù)荷，兒茶酚胺分泌過(guò)量加重心肌細(xì)胞損傷并誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。兒茶酚胺能夠促進(jìn)心肌蛋白合成及膠原蛋白累積，使心肌纖維化最終導(dǎo)致心臟肥大。內(nèi)皮素是一種有效的血管收縮肽，在調(diào)節(jié)心血管功能方面起著重要的作用。內(nèi)皮素Ⅰ已被證明可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)心肌肥大[13]。Wnt信號(hào)通路在正常情況下關(guān)閉，在壓力負(fù)荷下被激活，阻斷Wnt信號(hào)通路可降低由壓力負(fù)荷引起的心肌肥大。

3.2 心肌肥大的分類

心肌肥大主要分為生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。生理性心肌肥大表現(xiàn)為心肌細(xì)胞橫軸擴(kuò)大、數(shù)量增多、心室舒張的適應(yīng)性增加，常見(jiàn)于運(yùn)動(dòng)員及孕婦。生理性心肌肥大是可逆的，在一定情況下提高心臟的儲(chǔ)備力和收縮性。病理性心肌肥大是由于心臟在長(zhǎng)期的刺激下對(duì)氧化應(yīng)激和超負(fù)荷所做出的反應(yīng)。原發(fā)性高血壓、繼發(fā)性高血壓以及冠心病等多種疾病都會(huì)引起病理性心肌肥厚。心肌肥大早期仍可維持正常的心臟功能，晚期會(huì)導(dǎo)致心肌耗氧量增加以及心臟依從性和收縮力降低，最終導(dǎo)致失代償性的病理性心肌肥大，并容易導(dǎo)致心臟衰竭和心臟驟停[14]。

4 外泌體在心肌細(xì)胞肥大中的作用

4.1 心肌細(xì)胞源性外泌體與糖尿病心肌病心肌肥大

糖尿病心肌病是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病患者熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)表達(dá)的降低是導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)器官受損的關(guān)鍵因素。研究表明，糖尿病患者的心肌細(xì)胞能夠釋放含有少量HSP20的有害外泌體。在心臟特異性過(guò)表達(dá)HSP20的轉(zhuǎn)基因小鼠中證實(shí)心肌細(xì)胞源性外泌體參與HSP20介導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌重構(gòu)。2型糖尿病大鼠心肌細(xì)胞分泌的外泌體能夠抑制心肌內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成。此外，含有較高水平HSP20的外泌體能夠防止心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化，改善心肌收縮功能。因此，含有高水平HSP20的外泌體對(duì)糖尿病心肌病心肌肥大及心肌細(xì)胞損傷有一定的抑制作用[15]。

4.2 心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體與心肌肥大

血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的病理性心肌肥大與心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體有關(guān)。心肌成纖維細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)旁分泌作用于心肌細(xì)胞，使原代心肌細(xì)胞中血管緊張素、腎素、AT1R和AT2R mRNA的表達(dá)上調(diào)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ mRNA的表達(dá)下調(diào)[16]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在血壓的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)產(chǎn)生的終產(chǎn)物Ang Ⅱ不僅調(diào)節(jié)血管收縮、生長(zhǎng)和纖維化等功能，而且通過(guò)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)增加血管的通透性。Pironti等[17]從心臟壓力超負(fù)荷小鼠的血清中分離出含有大量Ang Ⅱ Ⅰ型受體(AT1R)的外泌體。在缺失β受體阻滯劑2的小鼠中證明了富集AT1R的外泌體由心肌細(xì)胞分泌；將富集AT1R的外泌體注入輸入Ang Ⅱ但被敲除 AT1R基因小鼠的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和腸系膜血管，使小鼠血壓升高，并有可能進(jìn)一步提高對(duì)RAAS的敏感性，可見(jiàn)AT1R通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β受體阻滯劑2在RAAS中發(fā)揮重要作用。Lyu等[16]發(fā)現(xiàn)抑制AT1R和AT2R受體可阻斷心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體誘導(dǎo)心肌細(xì)胞病理性肥大。此外，心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體能夠激活MAPK、ERK、p38、Akt和JNK等信號(hào)通路，促進(jìn)與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和spp1基因相關(guān)的Ang Ⅱ的合成和釋放。因此，心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體通過(guò)激活心肌細(xì)胞中的RAAS系統(tǒng)促進(jìn)Ang Ⅱ的產(chǎn)生和分泌，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。此外，心肌成纖維細(xì)胞源性外泌體富含miR-21_3p并作為心肌細(xì)胞肥大的一個(gè)重要的旁分泌信號(hào)中介。microRNA-21被轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞中，影響microRNA-21_3p目標(biāo)基因的表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)和SORBS2(sorbin and SH3 domain containing 2)的降低，而PDLIM5和SORBS2的降低將會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。通過(guò)注射“antagomiR-21”獲得的microRNA-21藥物的藥理抑制作用減弱Ang Ⅱ小鼠心臟肥大的發(fā)展[18]。

4.3 心肌球細(xì)胞源性外泌體與心肌梗死后心肌肥大

自體心肌球細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)移植可以使心肌梗死后受損的心肌再生，但是這一作用的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。Gallet等[19]發(fā)現(xiàn)，豬的CDCs分泌的外泌體在心肌梗死后的心肌重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，CDCs源性外泌體不僅減少注射部位心肌的纖維化，而且在整個(gè)機(jī)體內(nèi)都存在抗纖維化的效果。此外，CDCs源性外泌體阻止由心室重構(gòu)引起的心肌細(xì)胞肥大，明顯抑制梗死周圍心肌細(xì)胞肥厚性生長(zhǎng)，有助于心肌梗死周邊微動(dòng)脈的再生?？偟膩?lái)說(shuō)，CDCs外泌體治療在急性期和康復(fù)期心肌梗死的豬模型中改善了心室重構(gòu)、減少疤痕、促進(jìn)血管生成以及增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖。

4.4 心肌祖細(xì)胞源性外泌體與心肌肥大

心肌祖細(xì)胞源性外泌體提高了受損心臟的心肌功能，參與心肌細(xì)胞的保護(hù)與修復(fù)。體外實(shí)驗(yàn)[20]表明，氧化應(yīng)激可能會(huì)使心肌祖細(xì)胞外泌體的釋放增加，心肌祖細(xì)胞在H2O2刺激下釋放的外泌體更有效的抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激能夠使外泌體中microRNA-21的含量增加，并且microRNA-21通過(guò)作用于PDCD4(programmed cell death 4)抑制H9C2細(xì)胞凋亡。抑制細(xì)胞凋亡能夠減弱心肌細(xì)胞收縮功能衰退以及代償性肥大。因此，心肌祖細(xì)胞源性外泌體對(duì)急性心肌梗死后的心肌細(xì)胞肥大有保護(hù)作用。

4.5 外周循環(huán)外泌體中的microRNA與心肌細(xì)胞肥大

急性心肌梗死患者的血清中裝載miR-1和miR-133a的外泌體的含量較健康人顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1和miR-133a優(yōu)先在骨骼肌和心肌中表達(dá)，miR-133a 通過(guò)靶向調(diào)節(jié)RhoA、Cdc42以及 NELF-A/WHSC2抑制心肌細(xì)胞肥大，而miR-1通過(guò)靶向作用于Ras GTP酶激活蛋白、Cdk9、Rheb以及纖連蛋白抑制心肌細(xì)胞肥大，故攜帶miR-1和miR-133a的外泌體與心肌肥大的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[21]。

4.6 脂肪細(xì)胞源性外泌體與心肌肥大

脂肪細(xì)胞與心肌組織之間有著重要的聯(lián)系，但分子機(jī)制尚不明確。Fang等[22]發(fā)現(xiàn)，攜帶miR-200a的外泌體作為脂肪細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間的信息傳遞樞紐。miR-200a在脂肪細(xì)胞中表達(dá)豐富，在心肌、血管、骨骼肌中幾乎不表達(dá)，將脂肪細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的激活，導(dǎo)致富含miR-200a的脂肪細(xì)胞源性外泌體進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，心肌細(xì)胞吸收后通過(guò)抑制TSC1的表達(dá)及激活mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

5 展望

目前，外泌體在腫瘤、細(xì)胞免疫以及干細(xì)胞治療等領(lǐng)域的研究較為廣泛。但越來(lái)越多的研究表明，外泌體及其攜帶的多種生物活性物質(zhì)在不同病理狀態(tài)心肌細(xì)胞肥大的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。外泌體具有獨(dú)特的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能，其為成為與心肌細(xì)胞肥大相關(guān)的心血管疾病的早期診斷標(biāo)記物或藥物載體提供新思路。

利益沖突：無(wú)