促進(jìn)原位內(nèi)皮化
——冠狀動(dòng)脈支架生物活性涂層的研究進(jìn)展

張明 趙卓 張建奇 吳熙 張基昌

心血管疾病尤其是心肌梗死是全球臨床死亡的主要原因之一。在過(guò)去的幾十年中，冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)使全世界許多患者受益。然而，目前血管支架存在一定的缺點(diǎn)，尤其是內(nèi)皮化受損導(dǎo)致支架內(nèi)血栓形成和新生內(nèi)膜過(guò)度增生。原位內(nèi)皮化是解決再狹窄及支架內(nèi)晚期血栓形成最具前景的研究方向。

原位內(nèi)皮化是指在冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后，促進(jìn)功能性內(nèi)皮直接再生于支架表面。早期方法主要是吸引支架與血管接觸部位的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs），但是較低的ECs遷移率阻礙了這種方法實(shí)施。最近，捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的想法引起了極大關(guān)注。EPCs主要來(lái)自骨髓外周血中的循環(huán)單核細(xì)胞，并且能夠分化為成熟的ECs。最近的研究證實(shí)了EPCs在血管修復(fù)和重塑中的關(guān)鍵作用，其具有在體內(nèi)產(chǎn)生功能性內(nèi)皮的能力［1］。已有大量研究策略來(lái)增強(qiáng)生物材料的原位內(nèi)皮化，本文將簡(jiǎn)要總結(jié)一些主要策略，重點(diǎn)介紹一些最近的研究。

1 刺激性生物活性分子

一些生長(zhǎng)因子或生物小分子能夠刺激ECs的生長(zhǎng)。雖然這些生物分子通過(guò)各種生化途徑影響許多靶組織，但體內(nèi)和體外研究都已經(jīng)表明它們具有加速內(nèi)皮化的能力，簡(jiǎn)述如下。

1.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF以其在血管發(fā)育中的作用而得名，是細(xì)胞產(chǎn)生的一種信號(hào)蛋白，并且是ECs的重要調(diào)節(jié)分子，能夠促進(jìn)血管生成和分化。有研究發(fā)現(xiàn)，表面固定的VEGF能夠通過(guò)增加ECs黏附、增殖和遷移來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮化。VEGF也促進(jìn)了EPCs向ECs系的分化［2］。有趣的是，VEGF還可以作為趨化生物分子，通過(guò)靶向VEGF R1和VEGF R2受體促進(jìn)EPCs捕獲［3］。捕獲后，VEGF可誘導(dǎo)分化并支持ECs功能［4］?；谶@些研究，Takabatake等［5］開發(fā)了一種VEGF涂層的EPCs捕獲支架，并進(jìn)一步說(shuō)明它在減少新生血管內(nèi)膜增生方面相比于抗-CD34抗體支架更具有特異性和有效性。由于VEGF能夠促進(jìn)ECs的黏附和增殖，將其作為生物活性涂層固定在支架表面有望促進(jìn)支架置入后的內(nèi)皮化進(jìn)程。但需要注意的是，VEGF的突釋可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此VEGF安全地應(yīng)用于原位內(nèi)皮化需要被嚴(yán)格評(píng)估。

1.2 一氧化氮（nitric oxide，NO）

NO最近在心血管領(lǐng)域引起極大關(guān)注。NO能夠調(diào)節(jié)血栓形成，促進(jìn)ECs增殖，并在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)作用。值得關(guān)注的是，NO在抑制血小板激活和聚集、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMCs）增生和血管舒張方面也起到重要作用。Major等［6］報(bào)道了存在NO釋放的聚合物涂層能顯著減小血小板激活和血栓形成。Kushwaha等［7］發(fā)現(xiàn)被釋放或催化產(chǎn)生的NO不僅能顯著減少血小板的活化聚集，而且還能抑制SMCs增生。由于NO在體內(nèi)半衰期短，因此許多研究都將目標(biāo)瞄準(zhǔn)NO供體。Yang等［8］選取了具有仿生NO催化活性酶（谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）功能分子硒代胱胺（SeCA）作為支架涂層制備前驅(qū)體，成功在支架表面構(gòu)建具有可調(diào)控NO催化釋放功能的黏附涂層，實(shí)驗(yàn)表明這種涂層選擇性促進(jìn)ECs生長(zhǎng)，顯著抑制了支架內(nèi)再狹窄。

1.3 肝素

肝素以其抗凝血作用而聞名，是血管支架和移植物中最常用的藥物之一。肝素主要通過(guò)與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，增強(qiáng)對(duì)活化凝血酶和Xa因子的抑制作用而發(fā)揮其抗凝作用［9］。另外，肝素還具有抑制SMCs黏附和增殖的作用［10］。因此，在支架表面構(gòu)建肝素化涂層成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。Yang等［11］在支架表面固定肝素涂層，實(shí)驗(yàn)表明其不僅能夠增強(qiáng)支架的生物相容性、抑制SMCs增殖，還能促進(jìn)ECs增殖。這些研究表明功能多樣性的肝素在冠狀動(dòng)脈支架方面應(yīng)用具有廣闊的前景。但是，支架涂層表面肝素的含量會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同影響。Gong等［12］在豬體內(nèi)置入肝素涂層支架1個(gè)月后，表面肝素含量為2.6 μg/cm2實(shí)驗(yàn)組的ECs完全覆蓋，而6.3 μg/cm2實(shí)驗(yàn)組的表面ECs僅部分覆蓋。

2 選擇性細(xì)胞捕獲生物活性分子

在生物材料表面固定生物活性分子能夠選擇性捕獲EPCs（或ECs），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)原位內(nèi)皮化。這些生物活性分子包括抗體、多肽和適配子。

2.1 抗體

一般來(lái)說(shuō)，骨髓中的早期EPCs或者遷移到循環(huán)血液中不久的EPCs，其表面有3種特異性標(biāo)志物（CD34、CD133和VEGF R2）。因此，可以利用對(duì)早期EPCs表面受體具有特異性的抗體來(lái)改進(jìn)冠狀動(dòng)脈支架，通過(guò)捕獲EPCs來(lái)實(shí)現(xiàn)支架置入后快速原位內(nèi)皮化?？?CD34抗體是迄今為止用于支架涂層最常用的EPCs捕獲生物活性分子。盡管抗-CD34抗體已經(jīng)在介導(dǎo)EPCs捕獲領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可，但抗-CD34抗體的使用并非沒有問(wèn)題。CD34并不完全特異存在于EPCs，它也見于其他類型細(xì)胞的表達(dá)，如造血干細(xì)胞和血小板。因此，研究結(jié)果亦表明抗-CD34抗體支架長(zhǎng)期抗支架內(nèi)再狹窄效果不如預(yù)期顯著［13］。抗-VEGF R2抗體是另一種用于捕獲EPCs的抗體，VEGF R2除了在EPCs中的特異性表達(dá)，還在分化的ECs中表達(dá)，這表明捕獲VEGF R2可能比CD34更具有特異性。但目前并沒有讓人信服的研究比較出抗-VEGF R2抗體與抗-CD34抗體的優(yōu)劣。另外，VEGF R2也可以在一些巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，可能因此刺激產(chǎn)生一些不必要的免疫應(yīng)答。雖然CD133在EPCs中表達(dá)有所下降，但亦有研究應(yīng)用抗-CD133抗體捕獲EPCs。Sedaghat等［14］研究顯示抗-CD133抗體支架與裸金屬支架相比，在置入體內(nèi)后再內(nèi)皮化與新生內(nèi)皮形成方面比較并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。

2.2 細(xì)胞特異性結(jié)合肽

纖維粘連蛋白CS5區(qū)的多肽片段精氨酸-谷氨酰氨-天冬氨酸-纈氨酸（REDV）則能特異性識(shí)別整合素α4βl，并通過(guò)與該受體間的生物識(shí)別來(lái)介導(dǎo)材料表面ECs的選擇性黏附。

相對(duì)于抗體而言，多肽結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，具有更高的穩(wěn)定性，且不易變性失活。有學(xué)者在此領(lǐng)域做了大量深入前沿的研究，證實(shí)了REDV活性多肽可選擇性吸附ECs，加速內(nèi)皮化，改善支架表面界面，降低再狹窄［15-16］。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是與REDV相類似的肽序列。有報(bào)道表明ECs對(duì)環(huán)狀RGD（cRGD）的結(jié)合親和力高于鏈狀RGD，這可能是因?yàn)閏RGD的構(gòu)象更接近天然配體［17］。類似地，還發(fā)現(xiàn)其他黏附蛋白衍生肽序列對(duì)ECs黏附和遷移具有顯著影響，例如酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸（YIGSR）［18］；另一種由噬菌體衍生而來(lái)的多肽序列CRRETAWAC對(duì)ECs有較好的親和力，并且對(duì)血小板的親和力較低，有望解決支架內(nèi)血栓形成及再狹窄的問(wèn)題［19］。

2.3 細(xì)胞特異性適配子

核酸適配子是一條寡核苷酸序列，通過(guò)SELEX技術(shù)（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合，經(jīng)過(guò)篩選獲得親合力高、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子，這些靶子可以是小分子、大分子、甚至是整個(gè)細(xì)胞［20］。Hoffmann等［21-22］用SELEX技術(shù)，篩選出具有對(duì)EPCs高特異性的核酸適配子，并對(duì)其加工修飾。結(jié)果表明，改進(jìn)后的支架材料能有效地捕獲血液中的EPCs，加速內(nèi)皮化進(jìn)程。Rotmans等［23］在聚四氟乙烯血管支架上固定核酸適配子后，置入動(dòng)物體內(nèi)，第3天和第28天的隨訪結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的ECs覆蓋率較對(duì)照組顯著提高。值得注意的是，用于EPCs捕獲的適配子并未得到廣泛研究，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性及表現(xiàn)需要進(jìn)一步探索。據(jù)報(bào)道，有些適配子序列可能導(dǎo)致不良免疫反應(yīng)［24］。

3 其他方法

磁力用于增強(qiáng)特定部位的原位內(nèi)皮化。這通常通過(guò)用磁性顆粒標(biāo)記分離的EPCs來(lái)完成，例如超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米顆粒或微球，然后使用外部磁場(chǎng)定位在損傷部位［25-26］。然而，這種方法需要分離EPCs，這與原位內(nèi)皮化的目的相矛盾。盡管目前食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了SPIO納米粒子的使用，但微粒/納米粒子標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的長(zhǎng)期影響是不確定的［26］。

4 展望

原位內(nèi)皮化仍然是一個(gè)相對(duì)較新的概念，不僅意味著實(shí)現(xiàn)EPCs的捕獲和促進(jìn)分化，還意味著長(zhǎng)期維持ECs的能力。雖然已經(jīng)探索了許多策略，但未來(lái)的研究可能會(huì)結(jié)合這些策略，模仿ECs生產(chǎn)過(guò)程，將捕獲的生物分子、生長(zhǎng)刺激因子和適宜的基體材料相組合。其他前景可能包括加入特定藥物以增強(qiáng)內(nèi)皮化、抑制血小板或SMCs的聚集，并利用電刺激來(lái)吸引或排斥特定細(xì)胞。該領(lǐng)域絕對(duì)需要新穎的想法，隨著不斷增加的多學(xué)科合作，原位內(nèi)皮化有望解決目前支架置入后存在的支架內(nèi)血栓形成、晚期或極晚期支架內(nèi)再狹窄的問(wèn)題。