胰腺β細(xì)胞再生研究進(jìn)展

洪育蒲 石喬 王衛(wèi)星

武漢大學(xué)人民醫(yī)院普通外科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430060

【提要】 胰腺由外分泌部和內(nèi)分泌部組成，包括胰島素在內(nèi)的多種代謝性激素由胰島的內(nèi)分泌細(xì)胞合成。胰島的再生能力在出生后明顯受限，糖尿病導(dǎo)致的β細(xì)胞損傷后需要干預(yù)治療來促進(jìn)β細(xì)胞再生修復(fù)，目前主要是通過移植人類胰島及人多能干細(xì)胞來源的β細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充；其他方法包括刺激內(nèi)源性β細(xì)胞增殖，促進(jìn)其他細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞，以及從基因工程動(dòng)物中獲取胰島。

胰腺是控制能量消耗和代謝的核心器官，主要由包括腺泡和導(dǎo)管的外分泌部與胰島為主的內(nèi)分泌部構(gòu)成。腺泡細(xì)胞產(chǎn)生一系列消化酶，包括脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，以降解脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物。胰島5種內(nèi)分泌細(xì)胞各分泌一種激素，分別為胰島素(β細(xì)胞)，胰高血糖素(α細(xì)胞)，生長(zhǎng)抑素(δ細(xì)胞)，胰多肽(PP細(xì)胞)和胃饑餓素(ε細(xì)胞)。其中胰島素和胰高血糖素直接經(jīng)過致密的胰島內(nèi)血管網(wǎng)釋放入血，在維系血糖穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用。在胰腺炎和糖尿病過程中，炎性刺激、高血糖、高血脂以及胰島淀粉樣多肽引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，使腺泡細(xì)胞與β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受損[1-4]。糖尿病是世界上主要的健康問題之一，多種并發(fā)癥造成了沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其中以胰島素抵抗為主的2型糖尿病占大多數(shù)，研究表明，相對(duì)于正常人，2型糖尿病患者存在胰島β細(xì)胞數(shù)目減少[5]。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，所占比例為5%～10%，患者β細(xì)胞選擇性被破壞后導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素缺乏，必須依賴于胰島素替代治療。

近幾十年來，糖尿病患者逐年增加，許多研究集中在胰腺發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和再生領(lǐng)域。在生理狀態(tài)下，成人胰腺能否自發(fā)再生β細(xì)胞仍有待探索。增強(qiáng)或誘導(dǎo)胰島的固有再生能力，發(fā)明新方法增加分泌胰島素的β細(xì)胞數(shù)量對(duì)于治療糖尿病有著重要意義。本文就胰腺β細(xì)胞再生修復(fù)的研究進(jìn)展作一綜述。

一、胰島再生動(dòng)物模型

由于糖尿病的重要影響，有關(guān)胰腺再生的研究主要集中在胰島再生領(lǐng)域。胰島再生的研究依賴于動(dòng)物損傷模型，這些模型包括胰腺切除、胰管結(jié)扎、胰島細(xì)胞化學(xué)性損傷等。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胰腺切除90%并不影響血糖穩(wěn)態(tài)，提示剩余的胰島以強(qiáng)大的代償能力足以維持血糖水平[6]，而在未成年的嚙齒類動(dòng)物胰腺切除后，觀察到在切口處發(fā)生組織再生。然而，人的胰腺切除50%～60%將誘發(fā)胰島素依賴型糖尿病[7]。僅有少數(shù)兒童行胰腺切除后發(fā)生了組織再生，胰腺再生能力隨著增齡急劇下降，成年后胰腺再生能力消失[8]。

另一種動(dòng)物損傷模型是胰管結(jié)扎后模擬梗阻性胰腺炎，這種模型造成小鼠腺泡細(xì)胞廣泛死亡，但是胰島并未受損，也未見明顯的胰島再生[9]。此外，應(yīng)用鏈佐菌霉素或四氧嘧啶作為化學(xué)性毒素制備模型，結(jié)構(gòu)性模擬葡萄糖進(jìn)入成年動(dòng)物β細(xì)胞并選擇性破壞部分或全部的β細(xì)胞。盡管在這些動(dòng)物損傷模型中也未見β細(xì)胞再生[10]，但是在妊娠、肥胖或者胰島素抵抗情況下可以觀察到胰島增生[11-12]。

二、新生胰腺β細(xì)胞的方法

鑒于糖尿病患者數(shù)量眾多，對(duì)β細(xì)胞再生治療有著巨大的臨床需求。修復(fù)有功能的β細(xì)胞群，使得患者免于每日注射胰島素，有助于減少因胰島素劑量控制不佳導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥。由于1型糖尿病主要集中在青少年，β細(xì)胞的嚴(yán)重缺乏引起的血糖異?？赡芪＜吧?，對(duì)于β細(xì)胞再生治療的需求尤為迫切[13]。

尸體來源的胰島移植使得1型糖尿病患者獲益，并有部分患者維持多年無需胰島素替代治療[14]。然而，由于合適的供體來源有限以及需要長(zhǎng)期進(jìn)行免疫抑制治療，尸體來源的胰島移植范圍受限。為了讓更多的患者受益，擁有可靠的標(biāo)準(zhǔn)化的人工胰島以供移植之用，又不需免疫抑制治療是最佳選擇。另外，通過干預(yù)治療刺激內(nèi)源性的β細(xì)胞再生也是不錯(cuò)的選擇。

1．促進(jìn)干細(xì)胞分化：有研究在成年動(dòng)物和人類胰管及其周圍觀察到單個(gè)β細(xì)胞和小胰島的存在，提示成年的動(dòng)物或者人類胰腺存在著干細(xì)胞或祖細(xì)胞[15]。此外，在胰管結(jié)扎的小鼠導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中觀察到少量的神經(jīng)元素3陽性的內(nèi)分泌前體細(xì)胞[16]，并在α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中也觀察到胰島和導(dǎo)管周圍有神經(jīng)元素3陽性細(xì)胞存在[17]。

在對(duì)青蛙、魚類及小鼠這些動(dòng)物幼年時(shí)期的研究中已經(jīng)獲知從受精卵到成熟胰島發(fā)育過程涉及的關(guān)鍵步驟和信號(hào)通路[18-19]。從體細(xì)胞中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)實(shí)現(xiàn)突破，為產(chǎn)生患者所需要的特殊細(xì)胞群提供了新思路[20]。從人胚胎干細(xì)胞中獲得胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，需首先用信號(hào)分子引導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化，然后依次形成終末內(nèi)胚層、胰腺上皮、內(nèi)分泌祖細(xì)胞和胰島素陽性細(xì)胞[21]。誘導(dǎo)方案進(jìn)行優(yōu)化后，在體外成功促使人胚胎干細(xì)胞、iPSCs及胰十二指腸同源盒1(PDX1)陽性的祖細(xì)胞分化成對(duì)葡萄糖敏感的胰島細(xì)胞群，這些細(xì)胞群在形態(tài)和功能上與胰島相似，并在體內(nèi)進(jìn)一步成熟，對(duì)小鼠糖尿病模型起到治療作用[22-24]。在體外培養(yǎng)獲得包括β細(xì)胞和其他內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞群，如果能夠進(jìn)一步獲得含有血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞的細(xì)胞群，將更接近天然胰島。

盡管目前在干細(xì)胞研究中取得了顯著的進(jìn)展，在促進(jìn)干細(xì)胞分化成熟、減少雜質(zhì)細(xì)胞、避免排斥反應(yīng)等方面仍需繼續(xù)探索。

2．β細(xì)胞自我復(fù)制：刺激β細(xì)胞增殖是簡(jiǎn)單而直觀的補(bǔ)充β細(xì)胞群的方式。大量的生長(zhǎng)因子和促有絲分裂物質(zhì)被證實(shí)能促進(jìn)動(dòng)物的β細(xì)胞增殖，包括甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰高血糖素樣多肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子、胃泌素、表皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子以及腺苷酸激酶抑制劑等[11-12,25-26]，但是這些物質(zhì)并不能有效刺激人β細(xì)胞增殖。生理情況下，β細(xì)胞再生能力隨著增齡顯著降低，在年輕的嚙齒類動(dòng)物中β細(xì)胞維持著較高的增殖率，在1月齡大鼠中每天大約是4%，七月齡大鼠僅為0.5%[27]。人β細(xì)胞的大量增殖存在于幼年時(shí)期，特別是出生后1年內(nèi)[28-30]。在正常、妊娠、肥胖成人的胰腺標(biāo)本中很少檢測(cè)到β細(xì)胞復(fù)制的現(xiàn)象[31-32]。

人和小鼠的胰島存在著結(jié)構(gòu)和分子水平上的差別。小鼠的β細(xì)胞主要集中在胰島中央，而人類的β細(xì)胞在胰島中均勻分布。人類的β細(xì)胞以葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)和GLUT2作為主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子，而且表達(dá)肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物B(MAFB)這種在小鼠β細(xì)胞中不表達(dá)的因子[33-34]。盡管人β細(xì)胞存在控制細(xì)胞周期必需的分子元件(細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶等)，但是在妊娠、肥胖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，人β細(xì)胞并不能像小鼠或大鼠的β細(xì)胞那樣發(fā)生增殖。通過直接調(diào)節(jié)上述分子元件或者基因突變可以促使體外培養(yǎng)的人類β細(xì)胞進(jìn)行增殖[35-36]。另外，許多細(xì)胞周期因子被限制在成熟β細(xì)胞的胞質(zhì)中，無法轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞分裂程序[37]。在肥胖或胰島素抵抗時(shí)升高的血清胰島素和葡萄糖可能刺激β細(xì)胞增殖[38-39]，但具體的關(guān)鍵信號(hào)仍不清楚。多項(xiàng)研究通過化合物高通量篩查發(fā)現(xiàn)，雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A( DYRK1A)抑制劑可以有效刺激體外培養(yǎng)的人β細(xì)胞和體內(nèi)移植的人β細(xì)胞進(jìn)行增殖[40-42]。此外，包括鈣調(diào)磷酸酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑B1在內(nèi)的相關(guān)通路也被發(fā)現(xiàn)[43-44]。但是這些化合物的應(yīng)用大多伴隨著其他細(xì)胞的增殖，在細(xì)胞類型特異性、靶向干預(yù)胰島等方面仍需進(jìn)一步論證，以保證這些化合物作用于細(xì)胞周期過程中不會(huì)誘發(fā)腫瘤形成。

3．其他細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化：體細(xì)胞核移植為重新編程每個(gè)細(xì)胞成為其他類型細(xì)胞提供了可能[45]。相應(yīng)地，應(yīng)用β細(xì)胞發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子促使非β細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島素陽性細(xì)胞引起了研究者極大的興趣。將神經(jīng)元素3、PDX1、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(MAFA)三者組合的腺病毒載體導(dǎo)入到成年小鼠胰腺中可以有效促使腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島素陽性細(xì)胞[46-47]，由此產(chǎn)生的胰島素陽性細(xì)胞能維持長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性并改善糖尿病。腸道上皮細(xì)胞和胃竇細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)化為胰島素陽性細(xì)胞[48]。另外，神經(jīng)元素3陽性的小腸內(nèi)分泌祖細(xì)胞條件性敲除叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FOXO1)后也形成了胰島素陽性細(xì)胞[49]。這些研究提示胃腸道上皮細(xì)胞通過重新編程可能成為功能性β細(xì)胞的來源。還有細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的腺泡細(xì)胞[50]、FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)敲除的導(dǎo)管細(xì)胞[51]及轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)因子2(TGIF2)過表達(dá)的肝細(xì)胞[52]亦可轉(zhuǎn)化為胰島素陽性細(xì)胞。

胰島周圍有獨(dú)特的胰島素陽性細(xì)胞群被認(rèn)為是α細(xì)胞向β細(xì)胞的過渡狀態(tài)[53]。γ-氨基丁酸(GABA)可以促進(jìn)α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)期的GABA處理有利于增加β細(xì)胞群數(shù)量[17]。將包含PDX1和MAFA表達(dá)組件的腺病毒載體導(dǎo)入體外培養(yǎng)的小鼠和人類胰島中，可以觀察到α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化[54]。多項(xiàng)研究表明，包括腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、膽囊細(xì)胞及小腸細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為胰島素陽性細(xì)胞，但并不能形成穩(wěn)定的移植體，可能與不完全轉(zhuǎn)化或者表觀遺傳不穩(wěn)定有關(guān)[55-56]?；谶@些問題，將重編程方法應(yīng)用到臨床的主要挑戰(zhàn)就是如何優(yōu)化編程方案來形成穩(wěn)定而有功能的移植體。

4．基因工程動(dòng)物獲取胰島：有關(guān)以豬胰島為主的胰島異種器官移植方面的探索性研究已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)十年[57]。異種移植物的免疫排斥反應(yīng)和大量的豬逆轉(zhuǎn)錄病毒明顯阻礙了移植的成功。有研究應(yīng)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)將62個(gè)已知的豬逆轉(zhuǎn)錄病毒從皮膚細(xì)胞中敲除，并將這類皮膚細(xì)胞制成iPSCs，制備豬胰島移植供體[58-59]。為保持豬來源胰島的長(zhǎng)期存活和正常發(fā)揮功能，依賴于包裹技術(shù)的進(jìn)步以保護(hù)移植物免受人體免疫排斥。

5．促進(jìn)β細(xì)胞再分化： 長(zhǎng)期的高血糖和高血脂環(huán)境、慢性胰腺炎或胰腺癌導(dǎo)致的胰腺炎性環(huán)境及自身免疫性炎癥等應(yīng)激狀態(tài)均可導(dǎo)致胰腺β細(xì)功能失調(diào)，發(fā)生β細(xì)胞脫顆粒，甚至基因表達(dá)下調(diào)。β細(xì)胞去分化后將表達(dá)胰島祖細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)元素3[60]。目前，功能失調(diào)的β細(xì)胞是否普遍存在去分化，去分化過程在人類β細(xì)胞中是否可逆，均尚不清楚。在2型糖尿病患者通過飲食、運(yùn)動(dòng)、胰島素強(qiáng)化治療可以促使功能失調(diào)的β細(xì)胞恢復(fù)胰島素分泌能力。那么，尋找促使去分化β細(xì)胞發(fā)生再分化的藥物將成為糖尿病新的治療方式，并作為一種不產(chǎn)生新細(xì)胞的獨(dú)特的細(xì)胞再生方式。

三、細(xì)胞再生治療面臨的挑戰(zhàn)

為了保護(hù)尸體來源的β細(xì)胞移植物發(fā)揮功能，受體可以應(yīng)用免疫抑制藥物減少排斥反應(yīng)，但是不可避免地對(duì)β細(xì)胞產(chǎn)生不良反應(yīng)。另外一種方法是應(yīng)用生物工程材料制成微囊包裹移植的β細(xì)胞，將β細(xì)胞與免疫細(xì)胞隔離，但是這也不可避免地將其與血管隔離，并改變了β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性及對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，對(duì)β細(xì)胞的長(zhǎng)期生存和發(fā)揮功能將產(chǎn)生不利影響。為解決這些問題，一系列創(chuàng)新型材料被研發(fā)出來[61-62]。此外，在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中，多種免疫療法被證實(shí)可以改善甚至完全阻止免疫攻擊[63]，但是在臨床試驗(yàn)中，這些方案并不能使患者從中獲益。通過基因修飾胰島細(xì)胞群或者操縱受體的免疫系統(tǒng)等方法可能成為減輕免疫攻擊的另一途徑。

那么，獲得天然免疫耐受的β細(xì)胞移植物將是未來研究的方向。在長(zhǎng)期1型糖尿病的患者胰島中意外發(fā)現(xiàn)有β細(xì)胞仍表達(dá)胰島素，并對(duì)葡萄糖刺激敏感，提示這些細(xì)胞可能逃避了自身免疫攻擊而繼續(xù)發(fā)揮生理功能[64]。最近研究發(fā)現(xiàn)，正常的小鼠和人類胰島β細(xì)胞在分子和功能方面均存在著異質(zhì)性，并分為多個(gè)亞群[65-66]，其中存在著作為啟動(dòng)胰島素脈沖式釋放的起搏中心的β細(xì)胞亞群。針對(duì)人胰島標(biāo)本的深入研究，可以更深刻地認(rèn)識(shí)人β細(xì)胞的異質(zhì)性，以期獲得可以逃避自身免疫攻擊的β細(xì)胞。此外，來源于iPSCs的患者特異性細(xì)胞群可能是解決免疫排斥和增加免疫相容性的有效手段。

四、小結(jié)與展望

基于胰腺胚胎發(fā)育及生理和病理狀態(tài)下胰腺再生反應(yīng)的研究，制定胰腺β細(xì)胞再生策略將有著重要的指導(dǎo)意義。例如對(duì)胚胎發(fā)育過程中胰島形成的研究有助于促使人胚胎干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞群；對(duì)出生后胰島從不成熟過渡到成熟狀態(tài)的深入了解，將有助于在體外培育成熟的β細(xì)胞；探索調(diào)控肥胖和胰島素抵抗時(shí)胰島細(xì)胞群生理性增殖的信號(hào)通路，有助于研發(fā)促進(jìn)β細(xì)胞增殖而避免癌變風(fēng)險(xiǎn)的藥物。單細(xì)胞分析將為研究正常和病理情況下的胰島細(xì)胞異質(zhì)性、尋找免疫耐受的少數(shù)內(nèi)分泌細(xì)胞、明確人胚胎干細(xì)胞如何過渡到成熟β細(xì)胞、以及非β細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞等提供新的線索。在單細(xì)胞水平的活細(xì)胞成像技術(shù)將使得體內(nèi)固有胰島的鈣離子波、胰島素釋放及免疫相互作用可視化。

近年來雖然在胰腺再生方面有著顯著進(jìn)步，但是仍有一些問題亟待闡明。人類胰腺自然再生和修復(fù)的機(jī)制如何？在功能性和免疫性方面，胰腺β細(xì)胞的異質(zhì)性有何表現(xiàn)？厘清這些問題，將為未來研制出具有天然抵抗或者逃避自身免疫攻擊特性、無需材料包裹或者免疫抑制藥物的β細(xì)胞移植物奠定基礎(chǔ)。這不僅將使得糖尿病患者獲益，也將為其他自身免疫性疾病患者的治療提供新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突