Toll樣受體4與NOD樣受體3炎性小體在肥胖合并急性壞死性胰腺炎大鼠肝損傷中的作用

梅方超 余佳 洪育蒲 李滿 周瑜 尤運(yùn)冬 夏鶴 金洪忠 王衛(wèi)星

武漢大學(xué)人民醫(yī)院普外科，武漢 430060

肝臟是胰腺血液回流的第一站，急性胰腺炎(AP)時(shí)胰腺血流中的細(xì)胞因子及炎癥遞質(zhì)可引起急性肝損傷，從而進(jìn)一步加重胰腺炎病情，影響患者的預(yù)后。近年來(lái)隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，肥胖發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，肥胖可增加AP的發(fā)病率且可加重AP的病情[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)肥胖合并AP的患者肝組織炎癥因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平較非肥胖者明顯升高，認(rèn)為肥胖可以通過增加炎癥因子的表達(dá)加重肝損傷[3]。但肥胖加重炎癥反應(yīng)進(jìn)而加重肝損傷的機(jī)制尚不完全明確。本研究擬通過建立肥胖合并急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型，探討肥胖加重AP時(shí)肝損傷的可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料與試劑

高脂飼料(D12492)購(gòu)自北京華阜康公司，普通飼料由武漢大學(xué)人民醫(yī)院統(tǒng)一配制。牛磺膽酸鈉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用前用無(wú)菌生理鹽水溶解配制成5%?；悄懰徕c溶液。髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、NOD樣受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、IL-1β、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體購(gòu)自武漢谷歌公司，白細(xì)胞分化抗原68(cluster of differentiation 68，CD68)、熒光二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，即用型非生物素免疫組織化學(xué)EliVisionTMsuper檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物科技公司，丙二醛(malodiadehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司。

二、動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

SPF級(jí)SD大鼠24只，體重180～200 g(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、ANP組、肥胖組、肥胖ANP組，每組6只。正常組及ANP組給予普通飼料喂養(yǎng)8周；肥胖組及肥胖ANP組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周。8周后，正常組及肥胖組大鼠直接處死；ANP組及肥胖ANP組通過胰管逆行注射5%?；悄懰徕c溶液(1.0 ml/kg體重)制備ANP模型[4]，造模后12 h處死。

三、血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

處死前經(jīng)下腔靜脈采血，離心分離血清，-80℃保存。用全自動(dòng)生化儀(日本奧林巴斯2700)檢測(cè)血清淀粉酶(amylase，AMY)、脂肪酶(lipase，LIP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、三酰甘油(triglyceride，TG)及總膽固醇(total cholesterol，TC)水平。

四、胰腺和肝組織病理學(xué)檢查

大鼠處死后取胰頭和肝組織于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)行病理學(xué)檢查，并根據(jù)Schmidt等[5]的方法對(duì)胰腺水腫、腺泡壞死、出血、脂肪壞死、炎癥和血管周圍炎性浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分；根據(jù)Mota等[6]的方法對(duì)肝臟細(xì)胞的空泡變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死等進(jìn)行評(píng)分。

五、肝組織SOD及MDA檢測(cè)

取新鮮大鼠肝組織，制備肝組織勻漿，采用硫代巴比妥酸比色分析法檢測(cè)肝組織MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD水平。

六、肝組織中CD68、TLR4、NLRP3、MPO、IL-β、NF-κB及caspase-3表達(dá)檢測(cè)

取肝組織切片，采用免疫熒光法檢測(cè)CD68、TLR4、NLRP3、MPO、IL-β水平。在EDTA緩沖液中微波修復(fù)抗原，加入10%驢血清室溫下孵育45 min，加入羊抗鼠CD68(1∶200)、TLR4 (1∶300)、NLRP3 (1∶300)、MPO (1∶300)及IL-1β(1∶300)抗體，濕盒中4℃孵育過夜。室溫下復(fù)溫1 h，加入二抗(1∶200)室溫下孵育45 min，DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞質(zhì)呈紅色或綠色為陽(yáng)性，用Image pro-Plus軟件進(jìn)行分析。

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織NF-κB、caspase-3水平。肝組織切片在檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復(fù)抗原，加入3%雙氧水室溫下孵育10 min，加入羊抗鼠NF-κB、caspase-3抗體(1∶300)，濕盒中4℃孵育過夜。室溫下復(fù)溫1 h，加入試劑A液(35 μl)室溫下孵育15 min，加入試劑B液(35 μl)室溫下孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。光鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕黃色染色或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，用Image pro-Plus軟件進(jìn)行分析。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠血清AMY、LIP、ALT、AST、TG、TC水平比較

肥胖組血清TG、TC水平顯著高于正常組，其他指標(biāo)無(wú)顯著差異。除TG外，ANP組其他指標(biāo)均顯著高于正常組和肥胖組(P值均<0.05)。肥胖ANP組所有指標(biāo)與其他3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

表1 各組大鼠AMY、LIP、ALT、AST、TG、TC水平比較

注：與正常組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與肥胖組比較，cP<0.05

二、各組大鼠胰腺、肝臟病理評(píng)分比較

正常組和肥胖組胰腺結(jié)構(gòu)正常，無(wú)胰腺腺泡水腫、出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分分別為(0.50±0.54)、(0.66±0.51)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肥胖ANP組胰腺腺泡水腫、出血、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較ANP組明顯加重，病理評(píng)分顯著高于ANP組[(12.50±1.04)分比(9.5±1.04)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A～1D)。

正常組和肥胖組肝臟病理評(píng)分分別為(0.33±0.51)、(0.66±0.51)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肥胖ANP組肝細(xì)胞水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較ANP組加重，病理評(píng)分高于ANP組[(6.66±1.21)分比(3.33±1.03)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1E～1H)。

三、各組大鼠肝組織MDA、SOD、CD68、TLR4、NLRP3、NF-κB、IL-1β、MPO、caspase-3水平比較

肥胖組肝組織MDA水平較正常組明顯升高，SOD水平較正常組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他指標(biāo)與正常組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ANP組肝組織所有指標(biāo)均較正常組及肥胖組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肥胖ANP組肝組織所有指標(biāo)較其他3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖2、3、4)。

圖1 正常組、肥胖組、ANP組、肥胖ANP組大鼠胰腺(1A～1D)及肝臟(1E～1H)組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

組別 MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)CD68+/TLR4+CD68+/NLRP3+TLR4+/NLRP3+NF-κBIL-1βMPOcaspase-3正常組 2.01±0.3613.30±0.491.66±0.811.50±0.540.83±0.756.56±0.9613.43±2.161.83±0.7518.66±1.21ANP組 2.96±0.22a9.90±1.02a6.66±1.21a7.00±1.41a5.50±1.04a37.63±2.96a35.00±2.82a20.83±2.48a55.00±2.60a肥胖組 2.45±0.26ab11.31±1.03ab2.50±1.04b2.33±0.81b1.00±0.63b7.10±1.53b15.66±1.75b2.33±1.03b20.66±3.14b肥胖ANP組3.45±0.15abc6.71±0.70abc24.16±1.47abc25.00±2.60abc14.16±1.47abc58.80±6.75abc50.00±2.36abc35.33±6.88abc66.00±4.04abc

注：與正常組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與肥胖組比較，cP<0.05

圖2 正常組、肥胖組、ANP組、肥胖ANP組大鼠肝組織CD68(2A～2D)、TLR4(2E～2H)、NLRP3(2I～2L)表達(dá)(免疫熒光染色，×200)

圖3 正常組、肥胖組、ANP組、肥胖ANP組大鼠肝組織NF-κB(3A～3D，免疫組織化學(xué)染色)、IL-1β(3E～3H，免疫熒光染色)表達(dá)(×200)

圖4 正常組、肥胖組、ANP組、肥胖ANP組大鼠肝組織MPO(4A～4D，免疫熒光染色)、caspase-3(4E～4H，免疫組織化學(xué)染色)表達(dá)(×200)

討 論

AP是臨床上一種常見的消化系統(tǒng)急腹癥，發(fā)病急、進(jìn)展快，病情重者可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)并伴有多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，嚴(yán)重危害患者的生命健康[7]。AP的發(fā)病原因多樣，主要有膽管疾病、酒精性、高脂血癥、暴飲暴食、免疫性、手術(shù)、藥物性等因素，少數(shù)患者病因不明[8]。近年來(lái)，有研究認(rèn)為肥胖可增加AP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)且可以加重AP的病情，影響患者的預(yù)后[2]。

急性肝損傷(acute hepatic injury，AHI)是AP時(shí)一種常見的并發(fā)癥，約80%的AP患者可出現(xiàn)AHI，肝臟損傷可以加重患者病情，增加AP的病死率[1]。本研究結(jié)果顯示，ANP組血ALT、AST的水平及肝臟的病理均較正常組明顯升高，肥胖ANP組血ALT、AST水平及肝臟病理較ANP明顯升高，提示ANP時(shí)出現(xiàn)了肝損傷且肥胖可以加重ANP時(shí)肝損傷。AP時(shí)肝損傷的機(jī)制復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)AP時(shí)受損肝組織中氧化應(yīng)激及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重，改善氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)后肝損傷程度相應(yīng)減輕，提示氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)可能參與AP時(shí)AHI的過程[9]，但有關(guān)肥胖合并ANP時(shí)肝損傷的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖ANP組肝組織MDA、NF-κB、IL-1β及MPO水平較ANP組明顯增加，而SOD活性較ANP組明顯降低，提示ANP時(shí)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)參與了肝損傷，且肥胖可能加重氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)水平導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝損傷。

氧化應(yīng)激是由活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)大量生成，或機(jī)體內(nèi)抗氧化保護(hù)能力的下降導(dǎo)致組織損傷。MDA是由機(jī)體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，SOD是一種可以清除機(jī)體代謝過程產(chǎn)生的氧化物質(zhì)的抗氧化酶，氧化應(yīng)激時(shí)組織內(nèi)MDA含量增加，SOD活性降低，氧化應(yīng)激得到改善后MDA含量減少，SOD活性升高[10-11]。機(jī)體氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS可以通過多種途徑參與組織細(xì)胞的損傷：ROS可以直接引起線粒體功能紊亂、溶酶體膜破壞；活化氧化應(yīng)激敏感轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放；通過CD95受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。有研究認(rèn)為，肥胖者機(jī)體存在氧化和抗氧化失衡，呈現(xiàn)一種慢性炎癥狀態(tài)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠合并ANP時(shí)肝損傷更加嚴(yán)重，可能與肥胖大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激更加嚴(yán)重，通過介導(dǎo)釋放更多的炎癥因子導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)。

巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。CD68是一種常用的巨噬細(xì)胞標(biāo)記[14]。TLR4是Toll樣受體家族中的一種，TLR4/NF-κB信號(hào)通路的過度活化可以可產(chǎn)生大量的炎癥因子，導(dǎo)致機(jī)體損傷[15]。NLRP3炎癥小體在免疫系統(tǒng)起到重要的作用，NLRP3炎癥小體調(diào)控失衡時(shí)，可導(dǎo)致過量的炎癥因子的產(chǎn)生[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4[17]、NLRP3炎癥小體[18]與巨噬細(xì)胞的活化及其合成、分泌炎癥因子相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖ANP組肝組織中CD68+TLR4+、CD68+NLRP3+細(xì)胞數(shù)量較ANP組明顯增多，提示肥胖可能增加ANP時(shí)肝組織巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、NLRP3炎癥小體的活化程度產(chǎn)生更多的炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致AHI更加嚴(yán)重。另有研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥細(xì)胞內(nèi)，TLR4可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化，產(chǎn)生大量炎癥因子，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，肥胖ANP組TLR4+NLRP3+細(xì)胞數(shù)量較ANP組明顯增多，結(jié)合文獻(xiàn)及本結(jié)果推測(cè)肥胖可能導(dǎo)致ANP時(shí)肝組織巨噬細(xì)胞中TLR4活化更加明顯，進(jìn)一步調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化，產(chǎn)生大量的炎癥因子，最終導(dǎo)致肝損傷更加嚴(yán)重。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突