油菜品質性狀分子標記開發(fā)及QTL定位研究進展

江建霞，張俊英，李延莉，蔣美艷，王偉榮，周熙榮，楊立勇，孫超才

(上海市農業(yè)科學院作物育種栽培研究所，上海201403)

油菜是我國食用植物油的主要來源之一。2015年農業(yè)部發(fā)布的《中國農業(yè)展望報告(2015—2024)》指出：我國食用植物油消費中，豆油、菜籽油、棕櫚油和花生油分別約占44%、24%、16%和8%，預計2024年菜籽油消費所占比重將為25%。菜籽油不僅是人類重要的食用油，而且在工業(yè)中也有廣泛應用，如作為原料制備潤滑劑、生物柴油等，此外，菜籽餅富含蛋白質和氨基酸，是牲畜家禽飼料中的優(yōu)質蛋白飼源。近幾十年來，改良菜籽油的品質是科學家的主要育種目標。隨著基因組測序和分子標記技術的廣泛應用，分子標記輔助選擇(MAS)技術的不斷發(fā)展，油菜的油酸、亞油酸、亞麻酸、芥酸和硫苷等重要品質性狀相關的分子標記和QTL定位的研究成果越來越多。本文重點闡述近些年來利用分子標記技術對油菜的含油量以及油酸、亞麻酸、芥酸和硫苷等性狀進行遺傳圖譜構建、QTL定位和分子標記輔助育種的研究現(xiàn)狀。

1 油菜高含油量的QTL定位和連鎖分子標記的開發(fā)

目前，大田推廣種植的大部分商業(yè)種油菜的含油量在40%—50%，距理論含油量還有一定距離，而油菜籽的含油量是決定油菜經濟價值的主要因素，油菜含油量每提高1%相當于產量提高2.3%—2.5%，因此，提高油菜含油量是育種學家的重要育種目標[1]。

前人對油菜含油量進行了較多的研究，利用雜種優(yōu)勢提高甘藍型油菜含油量是其中一個重要途徑。Zhao等[2]利用德國品種‘Sollux’和中國品種‘Gaoyou’的雜交F1代培育的DH群體進行種子含油量相關QTLs定位，共獲得6個QTL位點和9個上位效應位點，它們對種子含油量及蛋白含量具有多效性，進一步鑒定獲得2個獨立控制含油量而不影響蛋白含量的QTL位點。張寧[3]以歐洲雙低油菜冬性品種‘Tapidor’和中國雙高油菜半冬性栽培種‘Ningyou7’為親本構建了TN DH系作圖群體，通過對群體進行基因型和表型分析，繪制遺傳圖譜并在C2連鎖群上發(fā)現(xiàn)了一個含油量QTL簇qcO.C2，并初步預測qcO.C2區(qū)間存在9個與油脂合成相關的候選基因。郭世星[4]利用加拿大引進品系CG38和人工合成甘藍型油菜品系B25的雜交后代BC1為作圖群體，采用SSR、RAPD和SRAP標記構建了一張包含20個連鎖群的甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜，并檢測到2個含油量相關QTL位點，它們位于第10連鎖群上的標記SSRRa2-EO和EM15ME14之間和第15連鎖群上的標記EM5MEllb和EM12ME14間，分別解釋4.43%和18.68%的表型變異。Wang等[5]將低含油量品種‘KenC-8’和高含油量品種‘N53-2’進行雜交產生F1，并通過F1代產生的DH系構建遺傳連鎖圖譜，該DH群體被種植在8個自然環(huán)境中，通過含油量性狀的表型分析和QTL定位，最終63個QTLs被鑒定得到，它們被進一步整合為24個一致性QTLs，其中5個QTLs來自于低含油量親本‘KenC-8’，19個QTLs來自于高含油量親本‘N53-2’。Teh等[6]利用兩個冬性的雙低油菜品種‘Sansibar’和‘Oase’的雜交F1代獲得的DH系進行脂肪酸組成、蛋白含量和含油量等性狀的QTL定位，最終得到含油量相關的5個微效QTL，命名為DE-Oil.1—DE-Oil.5，分別位于A01、A02、A07、C03-II、C08連鎖群上，且分別解釋了4.3%—6.7%的表型變異，共解釋了27.5%的表型變異。對含油量相關微效QTL進行候選基因的預測，獲得A01上的候選基因LPAAT(Bra037553)。Sun等[7]利用含油量約50%的高含油量品種‘zy036’和含油量約36%的低含油量品種‘51070’雜交獲得F1代進而獲得DH系，構建遺傳連鎖圖，共包含527個分子標記。結合多年多點的田間數(shù)據(jù)，一共鑒定得到12個含油量性狀相關的QTLs，其中9個高含油量的QTLs來自于高含油量品種‘zy036’。4個與種子含油量相關的候選基因(BnG44、BnG30、BnG40、BnG36)緊密連鎖的標記分別為GSNP39、GSSR161、GIFLP106和GIFLP046。Raboanatahiry等[8]通過將多個群體的QTL圖譜進行整合，對控制種子含油量和脂肪酸含量的基因和位點分布進行同線性分析，最后從57個重疊QTLs區(qū)間中鑒定得到61個與含油量有關的候選基因，通過網絡互作和通路分析，KASI、KASII、LPAAT、GPAT等基因與其它基因互作程度最高，它們可能影響種子含油量。

2 與油菜高油酸低亞麻酸相關的分子標記

油菜中油酸和亞麻酸的含量對食用品質、營養(yǎng)品質、存儲等方面有著重要的影響。首先，從食用品質方面考慮，高油酸含量的菜籽油中多不飽和脂肪酸含量相對較低，熱穩(wěn)定性強，能夠滿足如煎炸、糕點等食品加工行業(yè)的需要；其次，從營養(yǎng)品質方面考慮，菜籽油中油酸(C18∶1)等單不飽和脂肪酸更有益人體健康，而亞麻酸(C18∶3)含有三個不飽和鍵，極易氧化形成自由基，出現(xiàn)脂質過氧化反應，損傷細胞與細胞膜的結構和功能[9]，另一方面，α-亞麻酸(ALA)是EPA和DHA等的合成前體，而DHA和EPA對視網膜和神經發(fā)育以及免疫炎癥反應起著至關重要的作用[10-11]；最后，從儲存方面考慮，高油酸菜籽油在純化加熱過程中不容易被氧化，熱穩(wěn)定性好，而亞麻酸在高溫或強光照條件下容易被氧化導致油脂變質，不利于儲存。因此，綜合考慮菜籽油中油酸和亞麻酸含量對人體健康和儲存方面的影響，提高菜籽油中油酸含量，降低亞麻酸含量成為油菜品質育種中一個重要育種目標。

油菜種子中油酸和亞麻酸含量相關的分子標記的開發(fā)和利用尤為重要。Hu等[12]在一個甘藍型油菜的DH群體中定位得到2個油酸含量有關的QTL位點，包括位于N5連鎖群上的一個主效QTL位點(fad2基因)和位于N1連鎖群上的一個微效QTL位點。同時，他們還定位得到2個亞麻酸含量有關的QTL位點，其中主效QTL被證實為N14連鎖群上的fad3c基因，另一個主效QTL是N4連鎖群上的fad3a基因。將EMS突變體與野生型品種中fad2和fad3c基因序列比較，發(fā)現(xiàn)兩基因均發(fā)生單核苷酸突變，進而引起脂肪酸含量變化，根據(jù)突變體和野生型間fad2和fad3c的序列差異，設計的2個SNP標記在甘藍型油菜高油酸低亞麻酸輔助選擇育種中發(fā)揮重要作用。Javidfar等[13]獲得了8個與油酸和亞麻酸含量相關聯(lián)的RAPD標記，其中標記UBC2830擴增片段對油酸含量表型貢獻率為43%，對亞麻酸含量表型變異的貢獻率為13%，它在被變換成SCAR標記后可用于高油酸和低亞麻酸育種的標記輔助選擇。張潔夫等[14]利用含油量較低的低芥酸甘藍型油菜品系APL01(含油量37.03%，芥酸含量0.33%)和含油量較高的高芥酸抗菌核病品種‘M083’(含油量43.28%，芥酸含量42.65%)的回交群體，獲得了兩個與油酸含量相關的主效QTLs，它們分別位于N8連鎖群的m11e37b—A0226Ba267和N13連鎖群的m18e46—m20e25a，解釋11.73%和27.14%的表型變異。欽潔[15]利用低芥酸低硫苷冬性品種‘甲A177’與高油酸低亞麻酸的歐洲春油菜‘甲A254’雜交獲得F1代，并進一步獲得DH系，在DH群體中檢測到位于N5連鎖群上的1個油酸主效QTL，它解釋了84.6%的遺傳變異，另外還檢測到2個定位在N4和N14連鎖群上的亞麻酸主效QTL，分別解釋了59.0%和23.5%的遺傳變異。陳偉[16]在低芥酸低硫苷冬性品種‘甲A177’與高油酸低亞麻酸的歐洲春油菜‘甲A254’的雜交組合中，利用BSA法篩選得到一個控制油酸含量的主效QTL，位于SSR標記SSR373和BRGMS630之間，它對油酸含量的貢獻率為85.61%，利用兩個標記一起進行油酸含量性狀的前景選擇，獲得高油酸含量單株的正確率為94.12%；篩選得到兩個控制亞麻酸含量的QTLs，分別解釋了26.37%和25.18%的表型變異，由此推測亞麻酸含量性狀可能受多個基因共同控制，篩選獲得相關的分子標記有BM135、SSR698、BM44-2和SSR128-3。楊燕宇[17]利用無芥酸高油酸親本‘HOP’和無芥酸低油酸親本‘湘油15’雜交獲得的F2代分離群體，用SSR標記構建遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)了2個油酸含量相關的QTLs，分別位于A5和C5連鎖群上，它們分別解釋59%和16%的表型變異，其中位于A5連鎖群的QTL與FAD2基因有關。位于兩個QTL峰值上的標記為BrG23Y12和BrP06Y06，它們分別對應白菜A5染色體上的KBrB063G23和KBrB087P06這2個BACs。楊慶勇[18]在鑒定出甘藍型油菜中所有FAD2和FAD3基因的基礎上，試圖找到歐洲春油菜品系SW Hickory(油酸含量約為78%，亞麻酸含量小于3%)與普通雙低冬油菜品系 JA177(油酸含量為64%，亞麻酸含量為8%)材料之間的FAD2基因差異，結果表明高油酸親本SW Hickory中FAD2.a基因在第567和第568堿基對之間有一個4 bp的插入，該插入導致移碼突變，終止密碼子提前出現(xiàn)，據(jù)此開發(fā)了一個SCAR標記，可對油酸含量進行前景選擇，同時，根據(jù)FAD3基因在親本SW Hickory和JA177之間的單核苷酸差異，設計SNP標記用于低亞麻酸的分子標記輔助選擇。

3 甘藍型油菜芥酸含量的遺傳與QTL定位

芥酸是十字花科植物種子油脂中含量較高的脂肪酸之一，具有較長的碳鏈，在人體內不容易消化吸收，對于食用菜籽油而言，無芥酸或低芥酸含量(小于3%)是判斷菜籽油是否健康的一個重要指標，對于工業(yè)用菜籽油而言，高芥酸含量的菜籽油具有重要的經濟價值。大量研究結果表明芥酸含量由A8和C3染色體上的2個主要的QTLs調控，另外，也受一些微效QTL的影響[19-22，23]。甘藍型油菜中的BnaA08g11130D和BnaC03g65980D基因被證實是控制芥酸含量的2個主要基因，它們是擬南芥中控制芥酸含量基因FAE1的同源基因[24-29]。張潔夫等[30]用低含油量低芥酸的甘藍型油菜‘APL01’與高含油量高芥酸品種‘M083’雜交獲得F1，將F1與親本‘APL01’回交得到的BC1F1為作圖群體繪制遺傳圖譜，通過QTL掃描獲得2個芥酸含量相關的QTL，分別為qER8和qER13，其中qER8位于N8連鎖群的m11e37b和A0226Ba267標記之間，對芥酸含量的貢獻率為16.74%；qER13位于N13連鎖群的A0301Bb398和m18e46標記間，對芥酸含量的貢獻率為31.32%。qER8和qER13兩側的4個標記m11e37b、A0226Ba267、A0301Bb398和m18e46可用于油菜低芥酸育種過程中。林兵等[31]在甘藍型油菜A8連鎖群上共檢測到了14個芥酸含量相關QTLs，它們被整合成2個同義QTL，即qEA.A8.1和qEA.A8.2，其中qEA.A8.1是新發(fā)現(xiàn)的對種子芥酸含量具有顯著性作用的位點，而qEA.A8.2對應的候選基因是FAE-1。湯天澤[32]認為特高芥酸性狀主要受2對具有加性-顯性-上位性效應的主基因控制，同時受到多基因控制，以主基因效應為主，并獲得CB10364和BRMS-017這2個SSR標記，它們與芥酸含量緊密連鎖，在單株中同時出現(xiàn)時菜籽油中芥酸含量>57%，能較好地檢測出特高芥酸單株。

4 甘藍型油菜中硫代葡萄糖苷含量的分子標記和QTL定位

4.1 硫苷的化學性質及生物活性

硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是植物體內合成的一種含氮次級代謝產物，根據(jù)側鏈基團的不同，硫苷可分為脂肪族、芳香族和吲哚族三大類，至今已分離得到120多種硫苷[33]。以十字花科植物如擬南芥、花椰菜和青花菜中硫苷含量最高[34]，且種子中的含量最為豐富。硫苷經由芥子酶水解后產生異硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈等有生物活性的水解產物。早些年來，大田種植的油菜品種產生的菜籽油和菜籽餅中含有比較高濃度的硫苷，會對人體健康造成不利影響，畜禽等食用菜籽餅飼料后可能會引起臟器功能異?；虺霈F(xiàn)中毒等癥狀，限制了菜籽餅作為蛋白飼料的應用方式[35]。但是，近些年來，育種學家和科學家為了降低菜籽油中硫苷和芥酸含量做了大量研究和努力，育成了大批具有優(yōu)良農藝性狀的雙低油菜品種。

4.2 硫苷的遺傳

油菜基因組中存在3個控制硫苷含量的主效QTLs，分別位于染色體A9、C2和C9上[20,22，36-37]，與擬南芥MYB28基因同源的序列有3個，這3個同源序列分別位于控制硫苷含量的3個主效QTLs區(qū)間內，它們被認為是控制硫苷含量變異的候選基因[20,29，37]。MYB28是控制脂肪族硫苷合成的一個轉錄因子[38]。Wang等[39]利用GWAS結合高通量基因組重測序以及表型分析方法檢測甘藍型油菜種子含油量、芥酸和硫苷含量的多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)染色體A9、C2和C9上，調控硫苷含量的3個主效QTLs位點都存在MYB28基因，這進一步證實了MYB28基因可調控油菜籽中硫苷含量。Qu等[22]利用60K油菜SNP芯片對油菜籽中硫苷含量進行關聯(lián)作圖，發(fā)現(xiàn)11個與硫苷含量相關的SNP峰值，它們分別位于基因組A8、A9、C3和C9上，其中BnGRT2和BnMYB28基因被證實與硫苷含量相關。Marschalek等[40]發(fā)現(xiàn)控制甘藍型油菜中硫苷含量的6個QTLs中，有3個QTLs起主效作用，分別位于連鎖群9、16和18上，有3個QTLs的作用較小，分別位于連鎖群2、3和6上。Lionneton等[41]發(fā)現(xiàn)4個控制丙烯基硫苷的QTLs和2個控制3-丁烯基硫苷合成的QTLs，并且有2個控制丙烯基硫苷合成的QTLs與控制3-丁烯基硫苷合成的2個QTLs相互連鎖。Ripley等[42]發(fā)現(xiàn)，控制3-丁烯基硫苷合成的基因位于連鎖群2和11上，而控制丙烯基硫苷合成的基因位于連鎖群2和8上。

5 問題與展望

通過對油菜含油量及品質性狀相關分子標記和QTL定位的研究進展進行綜述，將前人的研究結果進行比較，歸納得到以下幾點結果：(1)控制種子含油量的QTL位點非常多，目前被報道的含油量性狀相關QTLs多達24個，已鑒定含油量相關的候選基因包括LPAAT(Bra037553)[6]、BnG27、BnG28、BnG30、BnG32、BnG36、BnG40、BnG44[7]、KASI、KASII、LPAAT、GPAT[8]等；(2)控制油酸含量的主效基因有N5連鎖群上的fad2基因，對應于白菜A5染色體上的KBrB063G23這個BAC，另外，N8、N13和N15等連鎖群上可能存在相關主效QTLs[12，15,17-18]；(3)可能存在2個控制亞麻酸含量的主效QTLs，分別為定位在N4連鎖群上的fad3a和N14連鎖群上的fad3c[12，15，18]；(4)甘藍型油菜中與擬南芥FAE1同源的兩個基因BnaA08g11130D和BnaC03g65980D被證實是控制芥酸含量的主效基因，另外，N6和N12、N7和N15、N8和N13等連鎖群上可能也存在控制芥酸含量相關QTLs，其中位于N8連鎖群的m11e37b和A0226Ba267標記間的qER8 對芥酸含量貢獻率為16.74%，位于N13連鎖群的A0301Bb398和m18e46標記間的qER13對芥酸含量的貢獻率為31.32%。qER8和qER13兩側的4個標記可應用于油菜低芥酸育種過程中，另外，N8連鎖群上的CB10364和BRMS-017這2個SSR分子標記與芥酸含量緊密連鎖，在單株中同時出現(xiàn)時，芥酸含量>57%，能很好地應用于特高芥酸單株的檢測中[24-26]；(5)油菜基因組中存在3個控制硫苷含量的主效QTLs，它們分別位于染色體A9、C2和C9上，這3個主效QTLs上的候選基因可能是擬南芥MYB28基因在油菜中對應的3個同源基因，另外，BnGRT2基因也被證實參與硫苷含量的調控，這些研究結果被高通量測序和SNP芯片結果證實[40-42]。目前，通過SSR和AFLP等分子標記方法對甘藍型油菜中的性狀相關基因進行QTL定位和進一步的候選基因篩選仍存在一些困難：首先，控制油菜含油量以及品質性狀的微效基因非常多，這些基因通過顯性效應、加性效應、上位性效應以及基因與環(huán)境的互作效應形成一個非常復雜的調控網絡，只有將多個QTL位點或基因進行有效聚合才能較大程度提高種子含油量和改良菜籽油品質；第二，由于甘藍型油菜是異源四倍體，基因組較大且重復序列多，而控制性狀的基因多數(shù)都是數(shù)量性狀基因，因而對這些基因進行QTL定位時常會得到多個QTL位點，主效基因或微效基因分布在多個連鎖群中，篩選候選基因的范圍擴大，需要開發(fā)大量的新的分子標記才能獲得高密度遺傳圖譜進而進行QTL定位或候選基因篩選，工作量很大。

分子標記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)是直接依據(jù)個體基因型進行選擇，克服了傳統(tǒng)育種中通過表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇造成的周期長、效率低、準確率低的缺點，可節(jié)約育種時間，提高育種效率。雖然近幾年來大量QTLs和分子標記被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，但是應用到育種和生產實際中的分子標記相對較少。陳偉等[16]利用篩選的油酸主效QTLs兩側的SSR標記(BRMS007和BRGMS630)，以及與亞麻酸含量相關的4個SSR標記(sN2025、BoGMS798、Nal2-D09和0110-D03)進行甘藍型油菜高油酸和低亞麻酸植株的選育，最終在BC2F2和BC3F2代獲得高油酸和低亞麻酸單株；劉梓諭等[43]篩選得到一個EST標記OC2-1，與含油量性狀關聯(lián)達極顯著水平，可在MAS中直接使用；Javidfar等[13]一共獲得了8個RAPD標記，它們與油酸和亞麻酸含量相關聯(lián)，其中標記UBC2830擴增片段對油酸和亞麻酸含量貢獻率分別為43%和13%，它在被變換成SCAR標記后可用于高油酸和低亞麻酸育種的標記輔助選擇；湯天澤[32]圍繞油菜籽的特高芥酸含量性狀展開了一系列遺傳研究，獲得CB10364和BRMS-017這2個SSR標記，它們與芥酸含量緊密連鎖，能較好檢測特高芥酸單株，可用于分子標記輔助選擇。近幾年來，隨著白菜、甘藍和甘藍型油菜基因組測序完成并且序列注釋的逐漸完善，尋找和開發(fā)分子標記的工作變得更加便利，開發(fā)更多的SSR、AFLP等分子標記將有利于更高密度的遺傳圖譜的繪制、QTL的精細定位及候選基因的篩選。分子標記輔助育種作為油菜育種的重要途徑，可進一步進行高效育種，獲得更多更好的高產、優(yōu)質、高抗油菜品種。