香蕉EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)

趙濤 王靜毅 劉菊華 徐碧玉 金志強(qiáng)

摘要：為發(fā)掘出一批香蕉的SNP位點、進(jìn)一步研究香蕉的遺傳關(guān)系、相關(guān)性狀的定位等打下基礎(chǔ)，從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的dbEST數(shù)據(jù)庫下載46 665條香蕉EST序列，經(jīng)生物信息學(xué)方法分析發(fā)掘EST-SNP位點，并對其所在核酸序列進(jìn)行功能注釋分析。通過對46 665條EST進(jìn)行拼接，共得到3 490條重疊群（contigs），在含有4條以上重疊群中發(fā)現(xiàn)有39條重疊群中含有SNP位點，從中篩選出127個候選SNP位點，其堿基突變類型中轉(zhuǎn)換、顛換分別占SNP位點總數(shù)的63.78%、36.22%。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)了34個與香蕉相關(guān)基因，證明NCBI中的香蕉EST數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量大，能夠發(fā)掘出SNP標(biāo)記對香蕉進(jìn)行品種鑒定、分類和遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞：香蕉;EST序列;SNP位點;重疊群;轉(zhuǎn)換;顛換;序列比對分析;遺傳多樣性

中圖分類號： S668.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0107-04

收稿日期：2018-08-03

基金項目：海南省重點研發(fā)計劃（編號：ZDYF2018097）;國家自然科學(xué)基金（編號：31501043）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-31）;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目（編號：1630052017018）。

作者簡介：趙濤（1990—），男，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向為園藝學(xué)。Tel：（0898）66890772;E-mail：2532450562@qq.com。

通信作者：金志強(qiáng)，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為熱帶果樹分子遺傳學(xué)，E-mail：zhiqiangjin2001@yahoo.com.cn;徐碧玉，博士，研究員，研究方向為熱帶園藝植物基因工程，E-mail：biyuxu@126.com。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指在基因組水平上，由單個核苷酸的變異導(dǎo)致等位基因的多態(tài)性，不同的等位基因在特定位置上含有不同的堿基對，等位基因頻率一般要大于1%。SNP變異類型有轉(zhuǎn)換（transition）、顛換（transversion）、插入（insert）和缺失（deletion）4種，通常只分析顛換和轉(zhuǎn)換。如果一個SNPs的次等位基因頻率大于0.1，便可用于關(guān)聯(lián)或者連鎖研究。單核苷酸多態(tài)性不僅分布在非編碼區(qū)，在編碼區(qū)也有分布，存在于編碼區(qū)的SNP稱為cSNP，這為研究者提供了豐富的生物信息。同時，SNP相比SSR具有更高的遺傳穩(wěn)定性。因此，現(xiàn)在人們廣泛的將其稱為第3代分子標(biāo)記，同時被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記[1-3]。

表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）是來源于功能基因表達(dá)的cDNA片段，是轉(zhuǎn)錄區(qū)域多態(tài)性識別的重要資源。隨著公共數(shù)據(jù)庫中EST序列的暴發(fā)式增長，以EST序列為基礎(chǔ)開發(fā)分子標(biāo)記變得越來越方便;同時，EST標(biāo)記還具有通用性好、信息量大、開發(fā)方法簡單快捷以及成本低等優(yōu)點。利用EST開發(fā)分子標(biāo)記可直接用于動植物分子育種等相關(guān)領(lǐng)域的研究[4]。

香蕉（Musa acuminata）屬于芭蕉科芭蕉屬，單子葉草本植物。目前，香蕉已經(jīng)成為我國熱帶地區(qū)主要農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，同時也是世界6億人口的主食作物[5]，更是世界四大水果之一。然而，近年來環(huán)境氣候的變化導(dǎo)致我國香蕉主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常遭受冷、干旱等逆境脅迫，同時香蕉枯萎病使得香蕉產(chǎn)業(yè)正遭受著毀滅性威脅[6]。目前，香蕉主栽品種大多是三倍體，基因組高度復(fù)雜，通常狀況下都是高度不育的，難以通過傳統(tǒng)的雜交育種得到優(yōu)良品種?，F(xiàn)在香蕉育種中如何進(jìn)行品種鑒定是難點之一。近年來，SNP已廣泛應(yīng)用于品種鑒定和重要性狀的基因定位、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等相關(guān)研究領(lǐng)域[7-13]。同時，國內(nèi)外在香蕉方面進(jìn)行開發(fā)SNP的文章鮮有報道。本研究利用NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)分析開發(fā)SNP，以期獲得合適的分子標(biāo)記，為香蕉育種株系鑒定提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1香蕉EST序列的獲取

從NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）通過關(guān)鍵詞“MUSA”搜索下載，共得到46 665條香蕉EST，所有EST序列均以FASTA格式保存。

1.2香蕉SNP的挖掘

利用SeqClean（http：//compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software）去除載體序列及冗余序列，之后使用CD-HIT（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit）和CAP3（http：//seq.cs.iastate.edu/cap3.html）進(jìn)行序列的聚類與拼接。利用QualitySNP（http：//www.bioinformatics.nUtools/snpweb/）尋找SNP位點。

1.3篩選原則

香蕉SNP位點篩選原則：（1）規(guī)定候選SNP位點兩側(cè)至少有5 bp堿基要完全保守;（2）候選SNP位點中的次要等位基因頻率至少為30%[14];（3）堿基判讀質(zhì)量與其所在的位置相關(guān)，測序所得的序列前區(qū)段質(zhì)量普遍偏低，應(yīng)選擇序列100 bp 以后的候選SNP位點。

1.4BLAST比對

提取含有SNP位點的重疊群（contigs）在NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，提取與序列相似性最高的序列注釋信息，對SNP靶向基因產(chǎn)物和物種來源進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1EST文庫來源

由表1可知，香蕉EST文庫數(shù)量多，但其序列主要來源于14個EST文庫，其數(shù)量為44 829條，占總EST的96.06%。香蕉EST文庫主要來源于香蕉A基因組，在所有的EST文庫中，來源于香蕉葉片組織的高達(dá)49.48%，來源于菜花樣芽分生組織的占23.72%，來源于香蕉根系的占11.09%，來源于香蕉果實的僅占5.41%。在香蕉EST文庫中源于Cachaco品種的最多，高達(dá)23.72%，其次為Calcutta 4-AA，占比為2000%，Grande Naine品種占14.05%，Pisang Awak（ABB）Sukari Ndizi（AB）Mpologoma（AAA）占11.77%，Pisang Klutug Wulung（PKW）-BB僅占11.33%，其品種和主要組織來源見表1。

2.2香蕉EST序列SNP頻率分析

如表2所示，在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載到46 665條香蕉EST序列，通過SeqClean去除序列冗余，得到有效的EST序列46 056條。使用CD-HIT和CAP3進(jìn)行序列的聚類與拼接，獲得3 490條重疊群，為了提高SNP位點的可靠性，本研究所用的重疊群EST條數(shù)均大于4，經(jīng)過QualitySNP軟件發(fā)掘SNP位點，在456條重疊群中發(fā)現(xiàn)39條中含有SNP位點，總計127個SNP位點。39條重疊群的堿基總數(shù)為35 743 bp，SNP出現(xiàn)的頻率為0.35%，即平均每281 bp含有1個SNP位點。39條重疊群中平均1條重疊群中含有3.2個SNP位點，含有SNP位點數(shù)最多的重疊群有14個位點，具體見表3。

如表4所示，本研究使用的EST序列包含SNP位點堿基轉(zhuǎn)換占比63.78%，顛換占比36.23%，堿基的插入、缺失不統(tǒng)計。在不同重疊群中不同突變類型SNP位點的數(shù)量差異較大，其分布密度變化也很大。

2.3SNP位點所在核苷酸序列同源性比對結(jié)果分析

提取39個含有SNP位點的重疊群在NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。本研究發(fā)現(xiàn)3個未知蛋白，可能是香蕉特有或尚未被發(fā)現(xiàn)的基因（表5），但須進(jìn)一步驗證。其他基因包括1個與抗逆有關(guān)的類熱休克蛋白，3個與蛋白質(zhì)降解、DNA損傷修復(fù)有關(guān)的泛素蛋白，1個CBS（cystathionine-beta-synthase）編碼胱硫醚-β-合成酶基因，4個與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的核糖體蛋白，1個與信號傳導(dǎo)相關(guān)的鈣調(diào)蛋白，1個參與真核翻譯起始進(jìn)程的真核翻譯起始因子，1個含LIM結(jié)構(gòu)域的LIM蛋白，1個與DNA結(jié)合的組蛋白，1個參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ADP-核糖基化因子，1個運輸?shù)鞍祝?個過氧化物酶基因，1個韌皮部蛋白以及1個磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)家族成員等，其具體的SNP位點的比對結(jié)果見表5。

3討論與結(jié)論

目前，開發(fā)EST-SNP的軟件眾多，軟件的選取以及如何設(shè)置參數(shù)都是影響試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。如PolyPhred只能預(yù)測某一核苷酸位點上單個堿基的替換，SNPdetector假陽性率和假陰性率均低，novoSNP的假陽性率明顯偏高;在具有可靠的參考序列時，SOAPsnp正確率較高;AutoSNP正確率低;QualitySNP預(yù)測位點少但正確率高于AutoSNP，且QualitySNP運行速度更快[15];因此，本研究應(yīng)選取QualitySNP開發(fā)SNP。

在EST序列中進(jìn)行SNP位點開發(fā)時，研究者應(yīng)當(dāng)注意影響SNP開發(fā)質(zhì)量的各種篩選參數(shù)。其中最主要的因素為重疊群的規(guī)格（重疊群所包含EST序列的數(shù)量）和次要等位基因（等位基因中出現(xiàn)次數(shù)較少的堿基）的出現(xiàn)次數(shù)。李猛利用QualitySNP軟件對葡萄EST序列進(jìn)行候選SNP位點分析時發(fā)現(xiàn)，為了得到高質(zhì)量的候選SNP位點，重疊群規(guī)格應(yīng)選擇拼接EST數(shù)量≥4條以上，同時次要等位基因至少出現(xiàn)2次[16]。因為錯配僅出現(xiàn)1次的話很可能是由序列差錯引起的，而同一堿基位置上發(fā)生2次序列差錯的概率則很小。因此在規(guī)格為4條，主次等位基因出現(xiàn)次數(shù)比為1 ∶1，即次要等位基因出現(xiàn)2次的重疊群中開發(fā)的候選SNP其可靠度較高。在規(guī)格大于4條的重疊群中，也應(yīng)當(dāng)盡量保證主次等位基因出現(xiàn)次數(shù)比近似為1 ∶1，即在規(guī)格為5～6條的重疊群中，次要等位基因應(yīng)至少出現(xiàn)2次。一般在聚類時為得到高的比對分值，通常須要在1條序列中加入空格，但這樣會被誤判為插入或缺失，為避免出現(xiàn)這種情況，在處理結(jié)果時可以不考慮插入或缺失，而只分析替換類型。

本研究從NCBI中dbEST公共數(shù)據(jù)庫下載46 665條EST序列，共有46 056條EST序列參與拼接，總計拼接成3 490條重疊群，所含EST序列≥4條的重疊群共456條，在39個重疊群中發(fā)現(xiàn)SNP位點。同時大于4條以上的重疊群主要由4～7條EST序列拼接而成，最多的1條重疊群也只有13條EST，8條以上EST拼接的重疊群比較少。同時，本研究中重疊群主要長度在800～1 500 bp，長度在1 500 bp以上的較少。一般為了提高SNP的可靠性，用于SNP分析的重疊群至少包含4條以上。

在39條重疊群中篩選出127個候選SNP位點，SNP頻率為0.35%，較甘蔗[14]、茶樹[17]等其他物種的SNP頻率低，可能是由于香蕉是三倍體植物自交高度不育，在生產(chǎn)上主要依靠吸芽和組培苗進(jìn)行繁殖生產(chǎn)，香蕉無法通過基因交流產(chǎn)生新的基因變化，所以自身遺傳差異變化小，SNP位點相比其他植物少。

一般情況下堿基轉(zhuǎn)換的C/T比A/G更常發(fā)生。CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）在基因組中最易發(fā)生突變，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶（T），因此轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3[17]。在本研究中，香蕉SNP位點堿基變異類型以G/A為主，占33.07%，C/T占30.70%，與甘蔗[14]、櫛孔扇貝[18]堿基變異類型相同，與小麥[19]、大麥[20]、辣椒[21]等物種的SNP堿基變異類型不符。轉(zhuǎn)換類型和顛換類型的數(shù)量分別占候選SNP位點總數(shù)的63.78%和36.22%，轉(zhuǎn)換與顛換比為1.76 ∶1.00，即轉(zhuǎn)換類型的數(shù)量明顯高于顛換，與檀小輝等的研究結(jié)果[14]存在差異。

本研究中，含有SNP位點最多的重疊群Contigs402和Contigs373分別有14、11個SNP位點，其EST構(gòu)成分別為5、4條，長度分別為852、863 bp。而只含有1個位點的Contigs97、Contigs287的EST組成分別為6、6條，長度分別為766、901 bp。由此看出，香蕉重疊群中EST序列數(shù)量與包含的SNP位點數(shù)量并無明顯規(guī)律，這可能與不同物種間SNP位點的分布差異有關(guān)。

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