成年小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞特異性ADAM10基因敲除的認(rèn)知功能研究*

黃忠興 何宏星 王亞新 邢作超 周常文 林炤華

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，福州 350122)(2. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，福州 350122)

動(dòng)物行為學(xué)研究是一種常用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或模式生物的實(shí)驗(yàn)方法，它通過觀察實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同變量下如：食物誘導(dǎo)、環(huán)境變化、電刺激等條件下的直觀應(yīng)答，記錄實(shí)驗(yàn)對(duì)象在心理情緒、生理功能等方面產(chǎn)生的變化，并以此了解變量可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的影響[1-2]。行為學(xué)研究常用的實(shí)驗(yàn)方法有morris水迷宮[3]、Y迷宮[4-5]、高架十字迷宮[1，6]、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[6-7]、黑箱實(shí)驗(yàn)等。

去整合素和金屬蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)是一種廣泛存在于細(xì)胞膜表面的蛋白酶。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ADAM10不僅可以通過非淀粉樣蛋白水解途徑裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)從而抑制了β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)的形成[8-9]，也可以通過N-鈣黏蛋白、Notch等信號(hào)途徑調(diào)控神經(jīng)元樹突的形成與成熟[10]，因此ADAM10與神經(jīng)退行性疾病特別是阿爾茲海默病密切相關(guān)。

本研究利用我們實(shí)驗(yàn)室建立的CaMKIIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ADAM10Floxp/Floxp轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，繁殖并制備出能夠存活至成年的大腦神經(jīng)細(xì)胞特異性ADAM10 cKO(conditional knock-out，條件性基因敲除)小鼠[11]。為了進(jìn)一步確定本實(shí)驗(yàn)室建立的條件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作為Alzheimer病的動(dòng)物模型[12]，我們通過Y迷宮的自發(fā)交替與新異探索實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)12月齡的ADAM10 cKO小鼠和對(duì)照組C57BL/6 J小鼠進(jìn)行評(píng)估，以了解ADAM10基因的缺失是否會(huì)對(duì)成年小鼠的自主活動(dòng)能力及探究學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

C57BL/6 J成年雄性小鼠10只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)，作為對(duì)照組，大腦神經(jīng)細(xì)胞特異性ADAM10 cKO成年雄性小鼠10只，作為實(shí)驗(yàn)組,均為12月齡。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前一周置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，室溫(23±2)℃，濕度50%左右，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Y迷宮儀器，共三個(gè)臂，各個(gè)臂夾角120度，每一臂尺寸為30 cm×8 cm×15 cm(長×寬×高)。高架十字迷宮儀器：由兩條開臂70 cm×8cm和兩條閉臂70 cm×8cm×5 cm，經(jīng)中央?yún)^(qū)8 cm×8 cm連接而成，封閉臂和開放臂的底部離地面50 cm，底面和壁部均漆成白色。曠場(chǎng)儀器：黑色敞口鐵皮箱40 cm×40 cm×40 cm，箱底劃為16個(gè)方格，沿箱壁格稱外周格，其余為中央格。實(shí)驗(yàn)儀器上方 1.5 m處安置攝像鏡頭，全過程錄像，及SMART 2.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析(PanLab, Barcelona, Spain)，為深圳瑞沃德公司引進(jìn)西班牙產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Y迷宮自發(fā)性交替實(shí)驗(yàn): 小鼠由其中一臂的末端放入，自由探索 8 min，實(shí)驗(yàn)人員脫離小鼠視線。行動(dòng)軌跡通過攝像跟蹤，依次記錄小鼠所進(jìn)入每個(gè)臂的順序號(hào)。由此統(tǒng)計(jì)進(jìn)入通道的總次數(shù)(total arm entries)和自發(fā)交替率。自發(fā)交替率(%)=含全部三個(gè)臂序號(hào)的三聯(lián)串總變換次數(shù)/進(jìn)入迷宮臂的可能變換次數(shù)(進(jìn)入臂的總次數(shù)-2)×100%[5]。通過Y迷宮自發(fā)交替性實(shí)驗(yàn)可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)能力[13]。

1.3.2Y迷宮新異探索實(shí)驗(yàn): 該實(shí)驗(yàn)分為兩部分，即實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)階段為訓(xùn)練期，第二個(gè)階段為檢測(cè)期。新異臂：在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)階段即訓(xùn)練期時(shí)用隔板遮擋住，在第二個(gè)階段即檢測(cè)期時(shí)打開；起始臂：小鼠進(jìn)入迷宮時(shí)所在的臂。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中起始臂和其他臂都是一直打開的，動(dòng)物可以自由出入。迷宮上方1.5 m處安置攝像鏡頭，全過程拍攝錄像。

1.3.2.1 訓(xùn)練期：新異臂被隔板擋住，小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動(dòng)10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，小鼠被放回飼養(yǎng)籠。2 h后進(jìn)行第二個(gè)階段即檢測(cè)期的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 檢測(cè)期：抽去新異臂的擋板，小鼠由起始臂放入，在3個(gè)臂中自由探索活動(dòng)5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只小鼠在各個(gè)臂停留的時(shí)間和穿梭次數(shù)[13]。

1.3.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn): 室內(nèi)安靜暗光。小鼠從中央?yún)^(qū)面向閉臂放入迷宮，記錄6 min內(nèi)的活動(dòng)情況，自動(dòng)攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄觀察指標(biāo)：小鼠進(jìn)入兩臂總次數(shù)、進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂滯留時(shí)間，開臂滯留時(shí)間%等?？梢酝ㄟ^比較小鼠在開臂和閉臂內(nèi)的滯留時(shí)間和路程來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)探索行為與焦慮行為[6]。

1.3.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn): 將小鼠放入正中一格。6 s后開始記錄6 min內(nèi)各項(xiàng)行為指標(biāo)。自動(dòng)攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄觀察指標(biāo)，其中包括：每只小鼠的爬行總距離、中央格進(jìn)入次數(shù)、滯留時(shí)間、運(yùn)行距離%、外周滯留時(shí)間、進(jìn)入邊角次數(shù)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等作為測(cè)試指標(biāo)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)兩組小鼠間的自主活動(dòng)能力和探究行為的差異[7]。

每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75% 乙醇擦拭、清洗實(shí)驗(yàn)儀器，并用紙巾擦拭干凈，以最大程度地減少動(dòng)物通過嗅覺進(jìn)行的線索識(shí)別。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)

cKO小鼠的自發(fā)交替率(0.50±0.28)%顯著小于對(duì)照組小鼠(0.74±0.14)%(P<0.05，圖1A)。總進(jìn)臂次數(shù)cKO小鼠(10.10±6.74)顯著小于對(duì)照組小鼠(20.30±8.93)(P<0.05,圖1B)。在迷宮中的總活動(dòng)路程cKO小鼠(5352.85±2213.65)cm顯著小于對(duì)照組小鼠(8724.81±2396.91)cm(P<0.01,圖1C)。

圖1 小鼠Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)注：A: 自發(fā)交替率；B：進(jìn)臂總次數(shù)；C：活動(dòng)總路程；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=10；*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Spontaneous alternation experiment of Y mazeNote：A: Spontaneous alternation rate;B: total numbers of arm entries; C: total distance moved. Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01

2.2 Y迷宮新異探索實(shí)驗(yàn)

在新異臂中探索的次數(shù)對(duì)照組小鼠(5.10±2.23)s顯著大于cKO小鼠(2.10±0.74)(P<0.01,圖2 A)。兩種小鼠探索新異臂所花的時(shí)間對(duì)照組小鼠(131.32±47.24)s顯著大于cKO小鼠(73.61±51.25)s(P<0.05,圖2B)。對(duì)照組小鼠在新異臂中活動(dòng)的路程(2771.50±868.51)cm顯著大于cKO小鼠(920.07±305.98)cm(P<0.001,圖2C)。

圖2 小鼠Y迷宮新異探索實(shí)驗(yàn)注：A：新異臂探索次數(shù)；B：新異臂探索時(shí)間；C：新異臂探索路程；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=10；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001Fig.2 New exploration experiment of Y mazeNote：A:munbers of times entering new arm; B: new arm time; C: distance in the new arm.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，開臂進(jìn)入次數(shù)對(duì)照組小鼠(8.5±1.7)顯著小于cKO小鼠(13.1±1.2)(P<0.05，圖3A)。開臂滯留時(shí)間對(duì)照組小鼠(46.5±9.3)顯著小于cKO小鼠(86.4±15.3)s(P<0.05，圖3B)。開臂滯留時(shí)間占總時(shí)間百分比對(duì)照組小鼠(12.9±2.5)顯著小于cKO小鼠(24.2±4.2)%(P<0.05，圖3C)。

圖3 小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)注：A: 進(jìn)入開臂次數(shù)；B：開臂滯留時(shí)間；C：開臂滯留時(shí)間占總時(shí)間百分比；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=10；*P<0.05Fig.3 mouse in elevated plus mazeNote：A: open arm entries; B: open arm time; C:percent of open arm/total time.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

從總體情況來看，對(duì)照組小鼠在6 min內(nèi)的活動(dòng)總路程為(7479±580.4)cm，cKO小鼠總路程為(6408±890.3)cm，二者無顯著性差異(P>0.05，圖4A)。對(duì)照組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)(56.2±11.7)顯著大于cKO小鼠(18.2±5.4)(P<0.001,圖4B)；兩種基因型小鼠進(jìn)入周邊區(qū)的次數(shù)分別為對(duì)照組小鼠(35.7±4.4)、cKO小鼠(35.4±5.7)兩者無顯著差異(P﹥0.05,圖4B)。從中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程占總路程的百分比來看，對(duì)照組小鼠(24.0±4.9)與cKO小鼠(7.8±1.7)之間無顯著差異(P=0.06,圖4C)。對(duì)照組小鼠在中央?yún)^(qū)的滯留時(shí)間(66.9±20.4)s顯著大于cKO小鼠(13.9±5.0)s(P<0.05)；周邊區(qū)滯留時(shí)間對(duì)照組小鼠(292.2±20.2)s顯著小于cKO小鼠(345.4±4.9)(P<0.05，圖4D)。

圖4 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)注：A：活動(dòng)總路程；B：進(jìn)入中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的次數(shù)；C：中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程占總路程百分比；D：中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)滯留時(shí)間；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=10，*P<0.05，***P<0.001Fig.4 Mouse in open field testNote：A:total distance moved;B: number of times entering the central area and out ring; C: percent of central area/total distance;D: time of central area and out ring. Data expressed as means±SEM,n=10， *P<0.05，***P<0.001

3 討論

在評(píng)估神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型中，Y迷宮的研究應(yīng)用十分廣泛，它是研究動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)能力和對(duì)空間辨別的學(xué)習(xí)記憶能力的常用實(shí)驗(yàn)方法[4-5]。為了進(jìn)一步確定本實(shí)驗(yàn)室建立的條件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作為Alzheimer病的動(dòng)物模型，ADAM10的缺失又是否會(huì)對(duì)成年小鼠的活動(dòng)能力及其空間辨別的學(xué)習(xí)記憶能力有影響。我們通過Y迷宮的方法對(duì)12月齡的ADAM10 cKO小鼠和對(duì)照C57BL/6 J成年小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，ADAM10 cKO小鼠與野生型C57BL/6 J小鼠相比較，其自發(fā)交替活動(dòng)減少，活動(dòng)能力下降，對(duì)新異空間的探索能力也有所下降。為了避免由于長時(shí)間實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致小鼠活動(dòng)能力降低繼發(fā)性引起實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差。實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)安排不同的小鼠對(duì)應(yīng)Y迷宮的起始臂、新異臂和其他臂，但是對(duì)于同一只小鼠而言，在迷宮實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)階段，三個(gè)臂是固定的。由于小鼠對(duì)該迷宮測(cè)試的記憶時(shí)間最長不超過數(shù)小時(shí)，所以該迷宮測(cè)試可以在同一只小鼠上反復(fù)進(jìn)行，但是兩次實(shí)驗(yàn)間隔需至少一周時(shí)間，并需改變?nèi)齻€(gè)臂的搭配。評(píng)價(jià)空間識(shí)別記憶能力可以用小鼠在新異臂中停留的時(shí)間和穿梭的路程作為檢測(cè)指標(biāo)，記憶損害者在新臂中探索的時(shí)間和路程會(huì)縮短。這說明ADAM10基因缺失降低了成年小鼠的活動(dòng)能力和其對(duì)空間辨別的學(xué)習(xí)記憶能力。ADAM10的缺失對(duì)小鼠造成了小鼠行為學(xué)方面的改變。

高架十字迷宮利用小鼠面對(duì)新事物(開臂)時(shí)會(huì)產(chǎn)生好奇心去探究,同時(shí)它們又有嗜暗的天性(閉臂),當(dāng)兩者之間發(fā)生探究與回避的沖突時(shí),容易引發(fā)焦慮心理，因此可以通過比較小鼠在迷宮開臂和閉臂中的行為表現(xiàn)來評(píng)估焦慮程度。在高架十字迷宮中，較對(duì)照小鼠，ADAM10 cKO 活動(dòng)軌跡更復(fù)雜，并且統(tǒng)計(jì)結(jié)果指標(biāo)明顯增加，即活動(dòng)總次數(shù)、進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂滯留時(shí)間s、開臂滯留時(shí)間%均有顯著增加。ADAM10 cKO小鼠在復(fù)雜環(huán)境中主動(dòng)活動(dòng)能力提高，焦慮感降低。這可能是由于ADAM10基因缺失后引起的神經(jīng)元樹突突觸前膜的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞的異常，進(jìn)一步引發(fā)小鼠焦慮感減弱，從而表現(xiàn)為在復(fù)雜環(huán)境下的低焦慮狀態(tài)和主動(dòng)活動(dòng)能力的提高。

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，較對(duì)照小鼠，ADAM10 cKO 小鼠活動(dòng)軌跡顯然更簡單，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指標(biāo)降低，即爬行總距離縮短，中央爬行距離%降低，進(jìn)入邊角次數(shù)和中央滯留時(shí)間顯著減少；而外周滯留時(shí)間明顯延長。張玲和林燕利用已構(gòu)建的APP轉(zhuǎn)基因鼠和APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠來研究小鼠的行為學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組小鼠相比，APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠活躍程度增加；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組小鼠相比，APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠活躍程度均降低[14]。Prox等研究發(fā)現(xiàn)：在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，較對(duì)照小鼠，ADAM10 cKO組小鼠行動(dòng)更加活躍；在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，較對(duì)照小鼠，ADAM10 cKO小鼠的社交活動(dòng)探索能力減弱[15]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中一致。與對(duì)照相比，ADAM10cKO小鼠焦慮情緒減弱，自主活動(dòng)能力和探究行為能力較差。

綜上所述，本研究利用Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)、Y迷宮新異臂探索實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了ADAM10 cKO小鼠的自主活動(dòng)能力和探究學(xué)習(xí)能力，其結(jié)果表明小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元ADAM10基因的缺失對(duì)小鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生了明顯影響。