利用產(chǎn)香酵母發(fā)酵技術(shù)改善煙葉品質(zhì)

胡志忠 姜 宇 龍章德 劉 鴻 鄒克興 蘇 贊 孫建生 李季剛 楊龍彥 許春平

(1. 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣西 南寧 530001；2. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在煙葉發(fā)酵過程中，微生物可以將煙葉中的一些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉降解為單糖和氨基酸等一些小分子，然后這些小分子物質(zhì)經(jīng)過一系列反應(yīng)可以生成醇、醛、酸、酯、酮等香味成分，從而提升煙葉的吸食品質(zhì)[1]。產(chǎn)香酵母是一類可以產(chǎn)生香味物質(zhì)的酵母菌，由于其生產(chǎn)的香味物質(zhì)種類繁多，在食品行業(yè)應(yīng)用十分廣泛，如白酒、葡萄酒、果汁、香精香料生產(chǎn)以及烘培面包等[2]。在煙草行業(yè)將產(chǎn)香酵母應(yīng)用于煙葉的報道并不多見，阮祥隱等[3]利用篩選出的Y1022酵母菌，以豆芽汁培養(yǎng)基對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后測定發(fā)酵產(chǎn)物中酯類物質(zhì)的含量，并將最優(yōu)產(chǎn)酯發(fā)酵條件下的發(fā)酵產(chǎn)物添加至卷煙中，與對照相比，添加后的卷煙煙香增加，香氣質(zhì)較好，并且能與煙香協(xié)調(diào)。陳篤建等[4]利用從煙葉表面篩選出的產(chǎn)香酵母對低等次煙葉進行發(fā)酵，卷煙的吸食舒適性提高，雜氣減少，煙氣清甜香更加突出。

煙葉石油醚提取物是以石油醚作為溶劑，對煙葉樣品進行萃取后得到的混合物，主要包括揮發(fā)油、樹脂、油脂、脂肪酸、蠟質(zhì)、類脂物、甾醇、色素等[5]。這一類物質(zhì)在煙葉成熟、調(diào)制、陳化和燃吸過程中，會經(jīng)過一系列的分解、轉(zhuǎn)化形成致香物質(zhì)，所以石油醚提取物含量越高，其香氣物質(zhì)越多。石油醚提取物含量常作為衡量煙葉品質(zhì)和香氣的重要指標(biāo)[6]。

在提取植物某些特定成分的研究中，利用石油醚提取物為目標(biāo)進行條件優(yōu)化的研究較多[7-9]，但以石油醚提取物的含量為優(yōu)化目標(biāo)對煙葉發(fā)酵條件進行優(yōu)化卻沒有相關(guān)報道。本研究擬利用從煙葉表面分離得到的一株產(chǎn)香酵母對煙葉進行發(fā)酵，以石油醚提取物的含量為指標(biāo)進行單因素優(yōu)化，根據(jù)正交試驗結(jié)果，再結(jié)合煙葉香氣物質(zhì)和常規(guī)化學(xué)成分的對比分析，以期探究出產(chǎn)香酵母對煙葉的最佳發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

興義B3F復(fù)烤后煙葉：2016年產(chǎn)，廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；

產(chǎn)香酵母C1：由煙葉表面分離，并保存在本實驗室；

石油醚：沸程30～60 ℃，煙臺市雙雙化工有限公司；

乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)：0.821 1 mg/mL，美國Sigma-Aldrich公司；

無水硫酸鈉：分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；

雙圈定性濾紙：通用電氣生物科技有限公司；

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.4。

1.1.2 儀器

生化培養(yǎng)箱：BPC-250F型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98-II型，天津市泰斯特儀器有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

水分測定儀：DSH-50A-1型，上海佑科儀器儀表有限公司；

紫外分光光度計：Ultra3400型，北京普源精電科技有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent 6890/5973型，美國Agilent公司；

連續(xù)流動分析儀：AA3型，德國Seal Analytical公司。

1.2 方法

1.2.1 煙葉發(fā)酵 將試驗所用的產(chǎn)香酵母C1從培養(yǎng)基接種2環(huán)到100 mL LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)48 h。將得到的種子液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液收集濕菌體，用無菌去離子水對濕菌體進行重懸，使用分光光度計確定稀釋倍數(shù)，使菌體濃度穩(wěn)定在108CFU/mL，測得此時OD600=1.45。

將煙葉去梗除雜，在(22±2) ℃、相對濕度60%條件下平衡48 h，然后測定含水率。采用固態(tài)發(fā)酵的方式，準(zhǔn)確稱取40 g濕基(含有水分的煙葉)置入托盤中，噴灑適量的無菌水和菌懸液使煙葉至一定含水率，用保鮮膜封口，于生化培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

(1) 最佳接種量：取40 g煙葉，量取1，2，3，4，5 mL 菌懸液均勻噴灑在煙葉上，補充水分至物料含水率為 40%，40 ℃發(fā)酵3 d，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉石油醚提取物含量。

(2) 最佳發(fā)酵溫度：取40 g煙葉，量取3 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，補充水分至物料含水率為 40%，分別在 25，30，35，40，45 ℃ 下發(fā)酵 3 d，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉石油醚提取物含量。

(3) 最佳發(fā)酵時間：取40 g煙葉，量取3 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，補充水分至物料含水率為 40%，分別在40 ℃ 下發(fā)酵 1，2，3，4，5 d，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉石油醚提取物含量。

(4) 最佳含水率：取40 g煙葉，量取3 mL菌懸液均勻噴灑在煙葉上，補充水分至物料含水率為 20%，30%，40%，50%，60%，40 ℃ 下發(fā)酵 3 d，發(fā)酵結(jié)束后測定煙葉石油醚提取物含量。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以煙葉石油醚提取物含量為考察指標(biāo)，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、煙葉含水率及接種量為考察因素，設(shè)計四因素三水平正交試驗，篩選影響煙葉石油醚提取物含量的主要因素，以確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 常規(guī)化學(xué)成分和香味物質(zhì)測定 確定最佳發(fā)酵條件后，另設(shè)一組對照試驗，由接種產(chǎn)香酵母改為噴灑等量無菌去離子水，其他發(fā)酵條件相同，發(fā)酵結(jié)束后測定常規(guī)化學(xué)成分和香味成分。

常規(guī)化學(xué)成分檢測采用YC/T 160—2002《煙草及煙草制品總植物堿的測定 連續(xù)流動法》、YC/T 162—2011《煙草及煙草制品氯的測定 連續(xù)流動法》和YC/T 173—2003《煙草機煙草制品中鉀的測定法 火焰光度法》測定煙堿、鉀和氯，采用文獻[10]的方法測定總糖和還原糖，采用文獻[11]的方法測定石油醚提取物的含量。

香味物質(zhì)含量采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，分析流程為：稱取處理后的樣品30 g進行粉碎，過60目篩，同時蒸餾萃取2.5 h，萃取劑為CH2Cl2。同蒸結(jié)束后，待萃取液冷卻至室溫后加入1 mL內(nèi)標(biāo)，然后加入無水硫酸鈉靜置一晚后進行濃縮，濃縮至1 mL至色譜瓶中進行GC/MS檢測。

色譜條件：HP-5MS(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)色譜柱；載氣為高純氦氣；進樣口溫度280 ℃；流速3 mL/min；分流比 5∶1。升溫程序：起始溫度50 ℃保持2 min，以8 ℃/min升至200 ℃，再以2 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度270 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～550m/z。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 煙葉的化學(xué)指標(biāo)均重復(fù)測定3次，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用Spss軟件采用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。利用Excel軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳發(fā)酵條件的探索

2.1.1 接種量 由圖1可見，石油醚提取物的含量隨酵母菌菌懸液用量的增加而升高，當(dāng)接種量為4 mL，即11.1%時，石油醚提取物達到最大值，隨著接種量繼續(xù)增加呈下降趨勢，可能是接種生物量過多，影響了菌種的生長代謝，從而產(chǎn)物降低。故酵母菌菌懸液的最佳接種量為4 mL。

圖1 接種量對煙葉石油醚提取物的影響

Figure 1 Effects of different inoculation amounts on petroleum ether extract of tobacco leaves

2.1.2 發(fā)酵溫度 發(fā)酵溫度會影響發(fā)酵過程中煙葉微生物和酶的分解作用，適宜的溫度會促進微生物和酶分解。由圖2可知，發(fā)酵溫度30 ℃時，石油醚提取物的含量最高，隨著溫度的繼續(xù)升高，呈下降趨勢，可能是過高溫度抑制了菌體的生長和代謝，故最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時間 發(fā)酵時間對微生物生長及其代謝產(chǎn)物有重要的影響。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，煙葉的石油醚提取物的含量逐漸增加，發(fā)酵第4天時，石油醚提取物含量的變化不再明顯，此時發(fā)酵應(yīng)趨于完全。隨著發(fā)酵時間的延長，煙葉顏色與外觀會發(fā)生嚴(yán)重變化，應(yīng)盡量減少發(fā)酵時間，故最佳發(fā)酵時間為3 d。

圖2 發(fā)酵溫度對煙葉石油醚提取物的影響

Figure 2 Effects of different temperature on petroleum ether extract of tobacco leaves

圖3 發(fā)酵時間對煙葉石油醚提取物的影響

2.1.4 含水率 發(fā)酵煙葉中水分過低，會影響微生物的生長和酶的活性。水分過高，則發(fā)酵煙葉易結(jié)塊， 影響其散熱及通氣性。由圖4可知，煙葉含水率為30%時，石油醚提取物的含量達到最大值，隨著含水率的繼續(xù)增加，石油醚提取物的含量呈逐漸下降的趨勢，可能是水分超過30%后，不利于酵母生長，影響了菌種的代謝，故最佳發(fā)酵含水率為30%。

圖4 含水率對煙葉石油醚提取物的影響

2.1.5 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取煙葉含水率、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度4因素，各因素選3水平進行正交試驗，以石油醚提取物含量為指標(biāo)，設(shè)計試驗方案見表1，結(jié)果見表2。

表1正交試驗因素與水平表

Table 1 Factors and levels of solid-state fermentation conditions of tobacco leaves by aroma producing yeast

水平A含水率/%B接種量/mLC時間/dD溫度/℃120322523043303405435

表2產(chǎn)香酵母固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

Table 2 Orthogonal test on the content of petroleum ether extract from tobacco leaves by solid-state fermentation with aroma producing yeast

序號ABCD石油醚提取物/%111116.14212226.29313337.20421236.36522315.73623128.45731326.44832136.51933216.60k16.546.317.036.16k26.856.776.427.06k36.527.426.466.69R0.331.110.610.90

從正交結(jié)果可知(表2)，產(chǎn)香酵母發(fā)酵煙葉時，發(fā)酵條件為煙葉含水率30%、接種量5 mL、發(fā)酵時間2 d、發(fā)酵溫度30 ℃，此時石油醚提取物含量最高為8.45%。由極差分析可得，各因素對石油醚提取物含量的影響顯著性由大到小為B>D>C>A，最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即煙葉含水率30%、接種量5 mL、發(fā)酵時間2 d、發(fā)酵溫度30 ℃，且與試驗最優(yōu)值結(jié)果相符。由此確定產(chǎn)香酵母發(fā)酵煙葉的最佳條件是：煙葉含水率30%、接種量5 mL、發(fā)酵時間2 d、發(fā)酵溫度30 ℃。

2.2 常規(guī)化學(xué)成分檢測結(jié)果

本試驗分別對發(fā)酵前后煙葉中總糖、還原糖、煙堿、鉀和氯的含量進行測定，結(jié)果見表3，對照組總糖與還原糖含量高于試驗組，可能是在發(fā)酵過程中接種的產(chǎn)香酵母以煙葉中的糖作為碳源進行生長繁殖；2組的煙堿含量并沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化；試驗組鉀氯比增加，煙葉的燃燒性增強；試驗組的糖堿比略低于對照組，為8.31。

表3產(chǎn)香酵母對煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的影響

Table 3 Effects of aroma producing yeast on the content of conventional chemical components in tobacco leaves

處理總糖/%還原糖/%煙堿/%鉀/%氯/%鉀氯比糖堿比對照組26.0922.152.891.710.612.809.03試驗組24.0219.622.891.790.593.038.31

2.3 香味物質(zhì)檢測結(jié)果

為了進一步分析產(chǎn)香酵母對煙葉品質(zhì)的影響，對處理后的復(fù)烤煙葉進行GC/MS分析，然后利用Nist11譜庫進行檢索，結(jié)果見表4，在對照組中，共檢測出醇類化合物5種、羰基類化合物16種、酸類化合物5種、酯類和內(nèi)酯13種、烴類化合物12種、雜環(huán)類化合物5種、酚類1種、酰胺和亞胺類化合物2種。

接種產(chǎn)香酵母進行固態(tài)發(fā)酵后，醇類化合物新增糠醇和金合歡醇2種，糠醇具有谷香、油香并且可以增加煙氣濃度，金合歡醇具有特有青香韻的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻；羰基類化合物新增十五烷醛和β-環(huán)檸檬醛2種，β-環(huán)檸檬醛具有甜香可以增加煙氣濃度和刺激性；酸類化合物新增辛酸1種，辛酸有甜香味，具有醇和煙氣的作用；酯類和內(nèi)酯新增十四酸甲酯1種，十四酸甲酯具有醇和煙氣的作用。

? “-”表示未檢出。

3 結(jié)論

本研究利用單因素和正交試驗設(shè)計，確定了產(chǎn)香酵母發(fā)酵煙葉的最佳條件，在最佳條件下發(fā)酵后的煙葉，醇類、羰基類、酸類、酯類和內(nèi)酯等香氣物質(zhì)種類增加，新植二烯含量增加。研究表明產(chǎn)香酵母通過代謝作用，促進了煙葉的醇化。

據(jù)報道[12-13]烤煙煙葉石油醚提取物含量高時，其香氣物質(zhì)較多，化學(xué)成分含量比例協(xié)調(diào)，煙草綜合質(zhì)量較好。本研究也證明了以石油醚提取物含量為優(yōu)化目標(biāo)對煙葉發(fā)酵條件進行優(yōu)化的可行性，下一步將針對石油醚提取物中的具體成分進行檢測分析，闡明其與煙草質(zhì)量的關(guān)系。