馬尾藻巖藻聚糖分離純化及對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇含量的影響

劉海韻 諶素華,2 王維民 黃娟娟 廖森泰

(1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610)

中國(guó)馬尾藻資源豐富，主要分布在西沙群島、南沙群島、硇洲島、海南島、潿洲島等海域中，且分布在近海岸，易獲得[1]。巖藻聚糖是馬尾藻的主要活性物質(zhì)，具有降血脂[2]、抗氧化[3]、抗癌[4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6]、抗凝血[7]、抗血栓[8]、提高免疫力[9]等作用，其生物活性與硫酸根的位置及數(shù)量有直接的關(guān)系[10]。有研究表明海藻中提取的巖藻聚糖可以有效地降低血清中膽固醇含量，如Park等[11]研究表明巖藻聚糖通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP-2以調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇和甘油三酯合成的關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)改善血清脂質(zhì)水平；Uehara等[12]研究表明ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCA1是細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子，也是促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體，主要介導(dǎo)血管壁上的巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)的膽固醇及磷脂流出，促進(jìn)RCT，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂；諶素華等[13]通過(guò)建立高脂血癥小鼠模型，研究了馬尾藻巖藻聚糖對(duì)脂代謝相關(guān)酶和膽固醇合成關(guān)鍵酶的影響，研究表明巖藻聚糖能夠顯著增加血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)、肝脂酶(HL)、脂蛋白脂酶(LPL)和肝臟LCAT、LPL活性，增加脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，加速總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)的分解代謝，或通過(guò)抑制膽固醇合成酶HMG-CoA還原酶降低膽固醇的合成。

采用常規(guī)水提方式提取巖藻聚糖的分子量較大，不易被生物吸收利用，其活性也往往不佳[14]，所以將純化的巖藻聚糖降解后再進(jìn)行相關(guān)活性研究越來(lái)越受到關(guān)注。蔡璐[15]1-2采用酸降解法獲得了低分子量的巖藻聚糖組分，并且用于小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)。但酸降解法有污染較重、反應(yīng)條件難以控制、硫酸基損失較大且降解結(jié)束后必須純化以除去酸等不足[16]，不利于進(jìn)一步的活性研究，所以本研究擬采用污染小、更高效、硫酸基保護(hù)效果優(yōu)異[17-18]的基于過(guò)氧化氫-抗壞血酸體系的自由基氧化降解法[19-20]得到低分子量的巖藻聚糖。本研究擬采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方式探討各不同組分對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇含量的影響，以期與小鼠體內(nèi)試驗(yàn)形成相互對(duì)照。由于動(dòng)物體內(nèi)的脂質(zhì)代謝途徑十分復(fù)雜，不確定因素太多，所以并不能僅僅依靠小鼠體內(nèi)試驗(yàn)就能完全定論巖藻聚糖具有良好的降血脂活性，還需要體外細(xì)胞試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步論證。所以還采用不同分子量的巖藻聚糖，以期使試驗(yàn)結(jié)果具有更多的延展性，能夠更為全面地論證巖藻聚糖的降血脂活性。本研究旨在為治療高膽固醇病癥提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為馬尾藻資源利用及巖藻聚糖生物活性開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

亨氏馬尾藻：2017年3月采摘于廣東湛江硇洲島海域，將采摘的亨氏馬尾藻除去爛葉、黃葉、根等不可食部分，反復(fù)用自來(lái)水沖洗干凈，在50 ℃烘干后粉碎，過(guò)80目篩，干燥后裝袋貯藏備用；

HepG2人體肝癌細(xì)胞：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；

DEAE C-52纖維素、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司；

Superdex 75葡聚糖凝膠：美國(guó)通用電氣公司；

DMEM培養(yǎng)液、FBS(胎牛血清)、PS(雙抗)、PBS磷酸緩沖液、DMSO(二甲基亞砜)、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、MTT(噻唑藍(lán))：西格瑪奧德里奇公司；

組織總膽固醇試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：AW120型，日本島津公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD8508型，韓國(guó)Ilshin公司；

CO2培養(yǎng)箱：MC0175型，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；

智能型倒置熒光顯微鏡：DMI4000B型，德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司；

全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Varioskan Flash型，美國(guó)熱電公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖的制取 將過(guò)篩后的馬尾藻粉按料液比1∶30(體積比)配成溶液，以60 ℃、350 W超聲50 min，然后在80 ℃的恒溫水浴浸提3.5 h。棄去沉淀，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為30%，濾除沉淀；繼續(xù)加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，取沉淀用丙酮和無(wú)水乙醇交替洗滌各2次。將沉淀用少量水溶解，按多糖溶液∶Sevag試劑=5∶1(體積比)的比例加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比)進(jìn)行脫蛋白。透析并真空冷凍干燥[15]13得粗多糖。

1.2.2 DEAE C-52纖維素陰離子交換層析 將DEAE C-52纖維素用蒸餾水清洗干凈，裝入2.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，至距離柱頂約5 cm處時(shí)停止裝柱，以蒸餾水平衡柱子。稱(chēng)取200 mg粗多糖溶于20 mL蒸餾水，依次用蒸餾水和1.3，2.3，3.0 mol/L NaCl 進(jìn)行分級(jí)洗脫。流速為1 mL/min，分步收集(5 mL/管)，以硫酸—苯酚法在490 nm處跟蹤檢測(cè)，分別收集洗脫峰，直至無(wú)糖組分流出，依吸光度對(duì)洗脫液管號(hào)作圖，得到洗脫曲線。合并相同峰位組分，透析48 h除鹽，45 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥[21]13得到HF0、HF1、HF2和HF3，其得率分別為13.98%，67.80%，17.04%，0.24%。

1.2.3 過(guò)氧化氫—抗壞血酸體系氧化降解 稱(chēng)取回收率最高的HF1組分300 mg，加入20 mL蒸餾水溶解，于30 ℃的恒溫水中加入0.103 6 g抗壞血酸，邊攪拌邊加入2%的過(guò)氧化氫1 mL，另稱(chēng)取300 mg的HF1，加入20 mL蒸餾水溶解，于30 ℃的恒溫水中加入0.259 0 g抗壞血酸，邊攪拌邊加入5%的過(guò)氧化氫1 mL，加完后開(kāi)始攪拌計(jì)時(shí)，反應(yīng)2 h后3 600 r/min離心10 min，棄沉淀，透析72 h后經(jīng)45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥[21]13得到HDF1和HDF2。

1.2.4 Superdex 75葡聚糖凝膠層析 將Superdex 75葡聚糖凝膠用蒸餾水清洗干凈，裝入1.6 cm×80 cm的玻璃層析柱，至距離柱頂約5 cm處時(shí)停止裝柱，以已過(guò)0.22 μm微孔濾膜的0.5 mol/L NaCl平衡柱子。將得率較高的HDF2用適量蒸餾水溶解，以已過(guò)膜的0.5 mol/L NaCl為洗脫液，洗脫速度為6 s/滴，每管收集3 mL，用苯酚—硫酸法測(cè)定吸光值，確定峰的變化，收集同一峰的多糖組分，經(jīng)過(guò)透析、45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、真空冷凍干燥[21]14得到HDF21和HDF22。

由于HF0為中性多糖組分，無(wú)理想生物活性，HF2、HF3回收率不高，HDF2全部用于了Superdex 75葡聚糖凝膠層析。所以本研究最終選擇HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分做進(jìn)一步研究。

1.2.5 化學(xué)成分分析

(1) 多糖含量測(cè)定：苯酚—硫酸法[22]。

(2) 硫酸基含量測(cè)定：氯化鋇—明膠比濁法[23]。

(3) 巖藻糖測(cè)定：半胱氨酸鹽酸鹽法[24]。

(4) 葡萄糖醛酸含量測(cè)定：改良的咔唑比色法[25]。

1.2.6 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)試劑配置

(1) 完全培養(yǎng)液：89% DMEM+10% FBS+1% PS。

(2) 細(xì)胞凍存液：50% DMEM+40% FBS+10% DMSO。

(3) 5 mg/mL MTT：稱(chēng)取25 mg MTT溶于5 mL PBS緩沖液中，避光，晃動(dòng)一段時(shí)間后置于超聲波中使其充分溶解，-20 ℃保存，使用前用完全培養(yǎng)基稀釋成0.5 mg/mL。

(4) 2 mg/mL多糖母液：分別稱(chēng)取10 mg HF1、HDF1、HDF21和HDF22溶于5 mL DMEM中，濃度為2 mg/mL，置于4 ℃下保存?zhèn)溆?，試?yàn)前用DMEM稀釋成需要的濃度，過(guò)0.22 μm針式濾膜。

1.2.7 HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存

(1) 細(xì)胞復(fù)蘇：取出細(xì)胞凍存管，放入流動(dòng)的37 ℃水中，期間不斷搖晃使細(xì)胞凍存液融化。加入適量的完全培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基后移入培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞形態(tài)。

(2) 細(xì)胞傳代培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用酒精噴在培養(yǎng)瓶表面消毒后，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞匯合度在70%～80%時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，在超凈工作臺(tái)中操作，棄去培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)液，加入 0.01 mol/L PBS緩沖液1 mL，洗滌細(xì)胞2次，吸出PBS緩沖液。再加入0.25%的胰蛋白酶2 mL，于培養(yǎng)箱中消化3 min，觀察細(xì)胞形態(tài)，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮變圓，細(xì)胞間隙變大即可加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，按一定的比例加入完全培養(yǎng)基吹打均勻，取10 μL于計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，按計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行稀釋?zhuān)盅b到新的培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。

(3) 細(xì)胞凍存：選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，次日將細(xì)胞進(jìn)行消化，終止消化后，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，按比例加入細(xì)胞凍存液，吹打搖晃均勻。每管吸取1 mL分裝到凍存管中，標(biāo)好日期和名稱(chēng)后分別于4 ℃冷凍30 min、-20 ℃ 冷凍1 h，最終在-80 ℃凍存。

1.2.8 MTT法制作HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞匯合度在80%左右時(shí)將細(xì)胞消化處理，然后用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL接種在96孔板上于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天同一時(shí)間取豎排的8孔細(xì)胞進(jìn)行MTT法處理，得到OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 不同濃度組分及其對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇含量的影響 將多糖樣品HF1、HDF1、HDF21、HDF22分別設(shè)2個(gè)濃度組，低濃度組(125 μg/mL) 和高濃度組(500 μg/mL)，并設(shè)立空白組。

(1) 細(xì)胞鋪板：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，稀釋成1×105個(gè)/mL，接種在6孔板中，每孔2 mL 3組平行，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) TC含量的測(cè)定：待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí)，棄去舊的培養(yǎng)液，用PBS洗2次后加入DMEM稀釋的多糖組分2 mL，分別培養(yǎng)24，48，72 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，再分2次加入1 mL PBS溶液，用刮板把6孔板中的細(xì)胞完全轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。于1 000 r/min 離心5 min后棄上清液，加入膽固醇試劑盒中100 μL的細(xì)胞裂解液，旋渦震蕩30 s后靜置5 min，反復(fù)3次共裂解25 min；于1 500 r/min 離心5 min，取上清液。

(3) 配制工作液：R1與R2體積比為4∶1，混勻，立即使用。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)簩? mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇稀釋為1 250.0，625.0，312.5，156.0，78.0，39.0 μmol/L。取10 μL于96孔板中，并設(shè)立空白對(duì)照組，3個(gè)平行；分別取10 μL 待測(cè)樣品加入96孔板中，3組平行，每孔加入190 μL工作液，充分搖勻，37 ℃反應(yīng)20 min后于550 nm處測(cè)OD值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品中膽固醇含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 亨氏馬尾藻巖藻聚糖化學(xué)組成

由表1可以看出，經(jīng)過(guò)分離純化和降解，HDF1的多糖含量、硫酸基含量和巖藻糖含量均高于HF1，但糖醛酸含量低于HF1。降解后的HDF1的多糖含量升高了14.14%。HDF21、HDF22的多糖含量分別降低了6.77%和8.80%，硫酸基含量分別降低了1.20%和5.88%。 HDF22的巖藻糖含量降低了5.02%，HDF21的糖醛酸含量降低了6.98%，但HDF21的巖藻糖含量有明顯的升高，提高了9.47%。因此，從數(shù)據(jù)來(lái)看，降解作用對(duì)HDF21的化學(xué)組成影響最大。

表1 亨氏馬尾藻巖藻聚糖不同組分的化學(xué)組成

2.2 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

由于該細(xì)胞為肝癌細(xì)胞，生長(zhǎng)速率快，由圖1可以看出，細(xì)胞在48～72 h處生長(zhǎng)最快，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而培養(yǎng)開(kāi)始及培養(yǎng)后期OD值變化不大，這是因?yàn)榧?xì)胞在最初數(shù)量較少，且處于適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程，培養(yǎng)一段時(shí)間之后，由于營(yíng)養(yǎng)充足，細(xì)胞增長(zhǎng)很快，后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的增多，細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢。

2.3 馬尾藻巖藻聚糖不同組分對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響

由圖2可知：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與空白組相比，不同組分不同濃度的巖藻聚糖均能不同程度地降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。其中HF1和HDF1在濃度為125 μg/mL時(shí)能極顯著降低(P<0.01)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。而當(dāng)HF1的濃度處于500 μg/mL，HDF21的濃度處于125 μg/mL時(shí)，也能顯著降低(P<0.05)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與空白組相比，只有HF1濃度為500 μg/mL 時(shí)才能極顯著降低(P<0.01)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量(降低了57.57%)；HF1、HDF1在濃度處于125 μg/mL，HDF22濃度處于500 μg/mL時(shí)能顯著降低(P<0.05)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。其他組膽固醇水平雖然低于空白組，但是沒(méi)有顯著差異。

圖1 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖2 不同組分及濃度巖藻聚糖硫酸酯對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的影響

Figure 2 Effects of different components and concentrations of fucoidan sulfate on intracellular cholesterol levels

細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)72 h后，與空白組相比，巖藻聚糖各個(gè)組分、各個(gè)濃度均能明顯降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。當(dāng)濃度處于125 μg/mL時(shí)，除了HDF21作用的細(xì)胞膽固醇含量沒(méi)有明顯變化外，HF1、HDF1、HDF22處理的細(xì)胞膽固醇含量均有顯著性降低(P<0.05)；而HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分的高濃度組(500 μg/mL)均能極顯著降低(P<0.01)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，分別降低了44.14%，57.64%，61.21%，54.09%。

綜上所述：與空白組相比，HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分在低濃度和高濃度分別作用細(xì)胞24，48，72 h 后均能降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，其中作用72 h時(shí)降膽固醇作用最佳。從圖2(c)來(lái)看，濃度為500 μg/mL時(shí)的HDF21降膽固醇的效果最好，降低了61.21%；其次為HDF1，降低了57.64%。同一組分的高濃度樣品效果好于低濃度，因此可以看出巖藻聚糖的降膽固醇作用不僅與時(shí)間有關(guān)還與濃度有關(guān)。

3 結(jié)論

將亨氏馬尾藻粉依次進(jìn)行超聲波輔助熱水浸提、乙醇分級(jí)沉淀、Sevag法脫蛋白、透析并真空冷凍干燥后得粗多糖，采用DEAE C-52分級(jí)純化得到HF1，經(jīng)自由基氧化降解得到HDF1、HDF2，HDF2經(jīng)Superdex 75分離純化得到HDF21、HDF22。分析了HF1、HDF1、HDF21、HDF22的化學(xué)組成：多糖含量分別為35.13%，49.27%，28.36%，26.33%；硫酸基含量分別為16.35%，17.52%，15.15%，10.47%；糖醛酸含量分別為12.53%，10.85%，5.55%，12.84%；巖藻糖含量分別為15.34%，17.52%，24.81%，10.32%。

研究了4種不同分子量的巖藻聚糖HF1、HDF1、HDF21和HDF22對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇含量的影響。結(jié)果表明，4種組分作用細(xì)胞后均能降低膽固醇含量，特別是4種組分的高濃度(500 μg/mL)作用72 h均能極顯著降低(P<0.01)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，HF1、HDF1、HDF21和HDF22組分別降低了44.14%，57.64%，61.21%，54.09%。這表明巖藻聚糖對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的影響可能具有一定的時(shí)效與量效關(guān)系，且4種組分中HDF21降膽固醇效果最好，可能與其分子量較低及糖鏈上的巖藻糖含量較高有關(guān)。

本研究采用細(xì)胞體外培養(yǎng)方式，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量探究了巖藻聚糖的降血脂活性。但由于脂質(zhì)代謝的復(fù)雜性，巖藻聚糖的降血脂機(jī)理尚不清楚，后續(xù)試驗(yàn)可以在巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)解析和細(xì)胞分子生物學(xué)的層面上作進(jìn)一步的探究。