不同病理類型及分期甲狀腺癌中miR-221miR-222 miR-197和miR-346的表達(dá)研究*

云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇 常青

(1.呼和浩特市第一醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其上升幅度居惡性腫瘤之首，且發(fā)病人群逐漸趨向年輕化[1]，故其近年備受關(guān)注，并成為腫瘤研究的熱點。其常用診斷方法包括觸診、超聲、核素顯像、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢等，其中細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是篩查和早期診斷甲狀腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在一定的假陰性率和部分無法確診的病例，且需考慮患者的依從性[2-3]。因此，研究鑒定早期診斷預(yù)警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題。越來越多的實驗數(shù)據(jù)逐步建立了腫瘤與miRNA表達(dá)變化的關(guān)聯(lián)，提示我們在不同的腫瘤中檢測特定的miRNA表達(dá)變化很可能成為腫瘤診斷、分期和預(yù)后預(yù)測的有力工具[4-5]。為了進一步證實其臨床效果，我們進行了此次研究，現(xiàn)將結(jié)果報告于下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月～2017年8月多中心收集的行甲狀腺手術(shù)的40例甲狀腺癌(乳頭狀癌、濾泡癌各20例)、癌旁正常甲狀腺組織(N-PTC)及20例良性甲狀腺疾病組織(MNG)。其中男性21例，女性39例；年齡16～65歲，平均(39.2±4.4)歲。采集前所有研究對象均了解研究的整個過程，且自愿參與，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。患者術(shù)前均未進行放化療治療，且不伴有影響研究的相關(guān)疾病，見表1。

1.2 方法 樣本總RNA的提?。簩⒔M織標(biāo)本在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入RNA提取試劑(Trizol試劑)1ml充分混勻，提取組織中總RNA[6]。逆轉(zhuǎn)錄PCR：取總RNA 1μl，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明加入各種反應(yīng)試劑，然后42℃反應(yīng)15min,85℃反應(yīng)5s,4℃反應(yīng)15min，后在-80℃下保存?zhèn)溆肹7]。實時PCR：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，加入PCR反應(yīng)試劑。將盛有混合物的反應(yīng)管置于實時PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min，再按95℃反應(yīng)15s,60℃反應(yīng)1min，擴增40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次[8]。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)剛開始進入到對數(shù)期的時候，原始模版的體系及濃度等差異暫時沒有放大，擴增目的片斷的量可以近似地看作僅僅與擴增效率及起始模板的濃度相關(guān)。用Pt值表示擴增目的片斷的量，含義是PCR中熒光信號達(dá)到規(guī)定閾值時的循環(huán)數(shù)。內(nèi)參應(yīng)用U6表示，陰性對照選擇水。應(yīng)用2-△△PT值表示樣品目的基因的相對表達(dá)率(PQ)。△PTtumor=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6)，△PTnormal=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6),△△PT=△PTtumor-△PTnormal，RQ=T÷N=2-△△PT(變化倍數(shù) fold-change),Log2[T/N]=-△△PT。當(dāng)RQ<1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達(dá)水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達(dá)水平低；當(dāng)RQ>1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達(dá)水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達(dá)水平高。

表1 兩組研究對象臨床資料比較(n，×10-2)Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2 結(jié)果

2.1 miRNA與甲狀腺癌的病理關(guān)系 在甲狀腺癌患者中，miR-221、miR-222的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、雙葉腫瘤等指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，見表2；miR-222在miR-197和miR-346的表達(dá)在20例甲狀腺濾泡癌中均有明顯升高，其余未見顯著變化，見表3。

表2 miR-221、miR-222的表達(dá)與甲狀腺癌病理及臨床特征的關(guān)系Table 2 The relationship between the expression of mir-221 and mir-222 and thyroid cancer pathology

Table3RelationshipbetweentheexpressionofmiR-197andmiR-346andthepathologicalchangesofthyroidcarcinoma

腫瘤類型nmiR-197表達(dá)量PmiR-346表達(dá)量P乳頭狀癌200.89±0.080.020.93±0.050.00濾泡癌 203.89±0.094.11±0.09

2.2 miRNA分子在相應(yīng)組織標(biāo)本中的表達(dá)水平 miR-221與miR-222在良性甲狀腺疾病組織的表達(dá)量變化不明顯,但是在甲狀腺癌組織中的表達(dá)變化顯著，即在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)顯著，兩者與PTNE的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(t221=-0.12,P221=0.00;t222=-0.13,P222=0.00)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在癌旁正常組織中的表達(dá)無明顯變化，見表4。在良性甲狀腺疾病組織中miR-197和miR-346表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)；在20例濾泡癌組織中明顯升高(P<0.05)，在乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中均無明顯變化，見表5。

Table4ExpressionlevelofmiR-221andmiR-222inthecorrespondingtissuespecimens

標(biāo)本miR-221PmiR-222P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.34±0.030.240.39±0.050.11 正常組織0.32±0.070.40±0.09甲狀腺癌 病灶組織0.85±0.010.000.99±0.020.00 癌旁正常組織0.31±0.070.40±0.01

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病率雖然只占全身腫瘤的1%、甲狀腺結(jié)節(jié)的5%，但卻是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一[9]。甲狀腺癌的發(fā)病隱匿，最初表現(xiàn)為無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，臨床診斷相當(dāng)困難。當(dāng)前多采用超聲、觸診、磁共振、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢、CT及核素顯像等方法進行診斷，其中細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是篩查及早期診斷甲狀腺癌較為有效的方法，但仍然存在一些假陰性和無法確診的病例[10-11]。因此，對早期診斷預(yù)警分子的研究與鑒定成為了目前甲狀腺癌所面臨的瓶頸問題，在臨床上有著重要的價值。

Table5LevelsofexpressionofmiR-197andmiR-346inthecorrespondingtissuespecimens

標(biāo)本miR-197PmiR-346P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.35±0.020.270.41±0.050.31 正常組織0.33±0.040.40±0.07甲狀腺癌 病灶組織4.11±0.090.003.89±0.090.00 癌旁正常組織0.41±0.040.40±0.03

近年來，大量臨床數(shù)據(jù)表明多種腫瘤的發(fā)生均與miRNA的異常表達(dá)有著密切關(guān)系，提示我們在不同的腫瘤中對特定的miRNA表達(dá)變化進行檢測很有可能會成為腫瘤診斷、分期及預(yù)后預(yù)測的有力工具[12-13]。miRNA是內(nèi)原性非編碼的一類小RNA,以堿基互補的形式與靶基因的表達(dá)相結(jié)合予以調(diào)控。miRNA不僅參與機體生長發(fā)育等正常生理過程，且在腫瘤等多種疾病的病理發(fā)展中扮演著重要角色[15]。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，miRNA能夠下調(diào)基因的表達(dá)；與此相反，具有癌基因樣功能的miRNA，能夠?qū)σ职┗虻谋磉_(dá)進行抑制。如果這些具有很強控制力的miRNA有了異常的變化，會將癌基因和抑癌基因之間的平衡破壞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在甲狀腺增生性結(jié)節(jié)是否行手術(shù)切除的判斷中，臨床上多采用術(shù)前細(xì)針穿刺，而miRNA技術(shù)僅僅可以依靠少量的細(xì)針穿刺標(biāo)本就能予以診斷，可有效地對甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺腫瘤進行區(qū)分，將不必要的甲狀腺切除手術(shù)避免[14-15]。

研究表明，在大多數(shù)腫瘤組織中miRNA分子家族的miR-221和miR-222均呈高表達(dá)水平[16]。本研究也證實甲狀腺癌中miR-221和miR-222的表達(dá)量明顯高于正常甲狀腺組織，表明其對甲狀腺癌的檢查結(jié)果會有一定的診斷輔助作用。在甲狀腺癌中，miR-221和miR-222的高表達(dá)與p27kip1蛋白的低水平表達(dá)有著密切的聯(lián)系，體外將miR-221與miR-222轉(zhuǎn)入到甲狀腺癌細(xì)胞中，會明顯減少p27kip1蛋白的表達(dá)，同時也抑制了兩者的表達(dá)，miR-221與miR-222的調(diào)控位點存在于p27kip1的3’-URT中，而細(xì)胞周期的調(diào)控有p27kip1的參與，充分表明甲狀腺癌細(xì)胞周期的調(diào)控中有miR-221與miR-222的參與。另外，miR-221和miR-222在細(xì)胞的分化及生長過程中也發(fā)揮著重要作用[17-18]。本研究證實，TNM分期越高，miR-221和miR-222的表達(dá)水平也就越高，意味著miR-221和miR-222很可能在參與甲狀腺癌發(fā)展及惡化過程中起到了重要作用；同時在甲狀腺癌存在淋巴轉(zhuǎn)移中的表達(dá)明顯高于非淋巴轉(zhuǎn)移組織，故其與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機制可能為miR-221和miR-222抑制了長壽保障基因和蛋白絡(luò)氨酸磷脂酶u等，從而加速了甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移，表明其與復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也有著密切的聯(lián)系。此外，本研究還顯示，miR-221和miR-222在甲狀腺乳頭狀癌中呈負(fù)相關(guān)，表明miRNA在甲狀腺腫瘤的診斷中有著潛在的應(yīng)用價值。

濾泡狀甲狀腺癌的惡性程度明顯高于乳頭狀甲狀腺癌，且兩者多伴隨發(fā)生。在濾泡狀甲狀腺癌的發(fā)生過程中，多種miRNA具有不同程度的高表達(dá)，這種細(xì)胞的表達(dá)多與細(xì)胞的類型有關(guān)系[19]。Weber等[20]研究證實miR-197和miR-346會導(dǎo)致濾泡狀甲狀腺癌133和K5細(xì)胞系的增長停滯，但是對乳頭狀甲狀腺癌卻無影響；亦證實了miR-197和miR-346沉默將會對濾泡狀甲狀腺癌的治療起到很大的促進作用。本研究表明，miR-197和miR-346在乳頭狀甲狀腺癌、正常組織和良性甲狀腺疾病組織中的表達(dá)均無顯著性，但在濾泡狀甲狀腺癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá)，因此miR-197和miR-346對濾泡狀甲狀腺癌的診斷與治療有著重要的臨床價值。此次研究有如下創(chuàng)新：①發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA，作為甲狀腺癌早期診斷、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的預(yù)警分子，為甲狀腺癌手術(shù)方式選擇及術(shù)后指導(dǎo)治療提供了參考及依據(jù)。②首次通過同一患者多中心性甲狀腺癌miRNA表達(dá)差異性情況，驗證其多灶性起源問題，并有望為今后甲狀腺癌特別是分化型甲狀腺癌手術(shù)術(shù)式提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同病理類型及分期甲狀腺癌中miRNA表達(dá)的不同，可為臨床早期診斷、預(yù)后分級、手術(shù)方式及術(shù)后治療提供判斷依據(jù)，可有效提高患者的生存質(zhì)量和預(yù)期壽命，減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，減少醫(yī)院醫(yī)療資源浪費，合理優(yōu)化醫(yī)療資源配置，具有較好的臨床及經(jīng)濟價值。