鄧蔡 張麗 歷丹 桂婷 冷衛(wèi)東
(湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院口腔醫(yī)學中心牙周科,湖北 十堰 442000)
牙周病是成人牙齒功能喪失的主要原因,同時還與部分系統(tǒng)性疾病有關(guān),對口腔及全身健康均有較大的影響[1]。牙周組織生理性和功能性的完全再生是治療此類疾病的最終目標,但由于牙周解剖結(jié)構(gòu)的特殊性,目前還未出現(xiàn)完全有效的治療方案[2-3]?;诟杉毎夹g(shù)的組織工程是牙周再生研究的新方向,目前首選種子細胞是牙周膜干細胞(periodontal ligament stemcells,PDLSCs)[4],但其需要拔牙才能獲得,應用受到限制。牙齦間充質(zhì)干細胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)同為牙源性種子細胞,獲得更為方便,本研究重點探討GMSCs作為牙周再生種子細胞的可行性,現(xiàn)報告如下。
1.1 實驗材料 細胞培養(yǎng)試劑:α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS,均購自美國Hyclone;0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜 DMSO、維生素C-二磷酸鹽、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、吲哚美辛,均購自美國Sigma;Dispase,購自美國Roche;L-谷氨酰胺,購自美國Gibco;青、鏈霉素(華北制藥)。轉(zhuǎn)染試劑:eFGP慢病毒載體,購自廣州賽業(yè)生物科技;潮霉素,購自美國Sigma。膜片及模型制備試劑:EDTA凝膠、戊巴比妥鈉、氯已定含漱液、阿替卡因腎上腺素注射液,均為國產(chǎn);自制0.5%氯化血紅素-維生素K1溶液、牛心腦浸液液體培養(yǎng)基、15%EDTA脫鈣液。檢測試劑:兔抗人多克隆GFP抗體,購自美國Cell signaling;免疫檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、DAPI染色液,購自北京中杉金橋生物;多聚賴氨酸粘片劑,購自美國Sigma;蘇木素、伊紅、二甲苯、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純。
1.2 實驗儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱,購自德國HERAcell;倒置相差攝像顯微鏡,購自德國leica;低速臺式大容量離心機、臺式高速離心機、分光光度計,均購自德國Eppendorf;流式細胞分析儀,購自美國Beckman;超低溫冰箱,購自美國Thermo Forma;厭氧菌培養(yǎng)箱,購自英國RUSKINN;麥氏比濁儀,購自美國BD;漩渦振蕩器,購自上海滬西分析儀器廠;全自動脫水機,購自英國SHANDON;偏振光顯微鏡,購自日本Olympus。
1.3 動物材料 雄性比格犬4只,體重(9±1.7)kg,9~12月齡,由同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供。
1.4 實驗方法
1.4.1 分離GMSCs和PDLSCs 征得患者同意后,采集牙周健康患者廢棄的小塊牙齦組織及健康前磨牙,原代培養(yǎng)GMSCs和PDLSCs,當細胞克隆生長達到培養(yǎng)瓶70%~80%后,以0.25%胰酶消化傳代。當長梭形細胞胞質(zhì)回縮為圓形時,終止消化。然后制備單細胞懸液。1:1傳代,使細胞均勻鋪于瓶底生長。當P1代細胞占瓶底的80%~90%后,再次將其制備為單細胞懸液,計數(shù)。隨后將細胞懸液稀釋至10個細胞/ml,接種到96孔板,100μl/孔,植入5%CO2、37℃孵育24h。于倒置顯微鏡下挑選并標記只含單個細胞的孔,加入培養(yǎng)液200μl培養(yǎng)。至30%~50%孔底面積被細胞鋪滿時,消化分離,獲得具有自我更新能力的GMSCs和PDLSCs。
1.4.2 制備可穩(wěn)定表達eGFP的GMSCs和PDLSCs 首先獲得慢病毒轉(zhuǎn)導最佳MOI值:制備P3代GMSCs和PDLSCs均勻細胞懸液,以103個/孔的細胞密度接種至96孔板,培養(yǎng)24h。采用無血清無雙抗的α-MEM培養(yǎng)基將病毒梯度稀釋至MOI分別為0、10、20、40、60、80、100、200,加入96孔板。在5%CO2、37℃飽和濕度下孵育。在熒光顯微鏡下持續(xù)觀察細胞生長狀況及綠色熒光蛋白表達情況,確定最佳MOI值。隨后以最佳MOI再次轉(zhuǎn)染細胞,轉(zhuǎn)染8h后換用含10%FBS的新鮮α-MEM培養(yǎng)基,48h后換含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達eGFP的細胞。
1.4.3 制備GMSCs和PDLSCs膜片 將能夠穩(wěn)定表達eGFP的P4代GMSCs和PDLSCs吹打為單細胞懸液,均勻接種至培養(yǎng)皿,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h,細胞充分貼壁伸展后加入膜片誘導培養(yǎng)液。至倒置顯微鏡下課觀察到底部邊緣出現(xiàn)細胞褶皺后結(jié)束培養(yǎng)。
1.4.4 動物模型制備 4只雄性比格犬均選擇雙側(cè)下頜第2、3、4前磨牙(P2、P3、P4)作為手術(shù)牙位制備模型。首先以我院臨床中重度慢性牙周炎患者為取材對象,培養(yǎng)牙周來源的混合厭氧菌,培養(yǎng)至菌液濃度1.5×109CFU/ml后應用。隨后手術(shù)暴露P2、P3、P4唇舌側(cè)骨板,翻瓣后磨除根分叉區(qū)牙槽骨,制備冠根向約5mm缺損,磨除牙根處牙槽骨。蘸取混合菌液70μl,置于缺損內(nèi),縫合粘骨膜瓣。模型建立約2周后,可觀察牙齦紅腫,探診出血,提示成功建立牙周炎Ⅲ度根分叉病變模型。開展牙齦基礎(chǔ)治療,并每日采用復方氯已定含漱液進行口腔衛(wèi)生護理。
1.4.5 分組及膜片植入 每只比格犬單側(cè)3顆患牙分別采用植入GMSCs膜片(GMSCs組)、PDLSCs膜片(PDLSCs組),或不植入膜片(空白對照組)。保證單側(cè)3顆患牙處理方案不同、雙側(cè)同名牙處理方案不同。細胞膜片植入根分叉骨缺損區(qū),術(shù)后3d給予5萬單位/kg青霉素肌注,每天2次,每日繼續(xù)應用復方氯已定含漱液,直至10天后拆線。拆線后每2~3天應用復方氯已定含漱液。
1.4.6 標本處理 膜片植入8周后,處死比格犬,取出實驗牙及周圍組織,脫鈣后將每顆牙齒以近遠中方向自牙體中央切成頰側(cè)、舌側(cè)兩部分,分別包埋、制備3μm厚切片備用。
1.5 觀察項目
1.5.1 HE染色 隨機選取每個標本中的3張切片,經(jīng)常規(guī)HE染色后光學顯微鏡下觀察形態(tài)學改變,測量如下指標:缺損高度、新生牙骨質(zhì)百分比、新生骨面積百分比。其中新生牙骨質(zhì)百分比指根分叉區(qū)新生牙骨質(zhì)長度占牙根的比例;新生骨面積百分比指新生小梁骨占根分叉區(qū)缺損總面積的百分比。
1.5.2 天狼星紅染色 隨機選取每個標本中的3張切片,開展天狼星紅-苦味酸試驗,在偏光顯微鏡下觀察新生牙周膜中的膠原纖維。評價標準:Ⅰ型,指膠原纖維緊密排布,雙折光性強,纖維顏色呈黃色或紅色;Ⅱ型指膠原纖維雙折光性弱,排布呈疏松網(wǎng)狀,顏色不固定;Ⅲ型指膠原纖維雙折光性弱,呈綠色的細纖維;Ⅳ型指僅可見顯示弱雙折光的基膜,呈淡黃色。
1.5.3 免疫組化分析 切片標本采用免疫組化二步法檢測GFP在新生牙周組織中的分布情況。
2.1 3組HE染色結(jié)果比較 兩種干細胞膜片植入后,根分叉區(qū)均有明顯的牙槽骨和骨質(zhì)再生,但新生牙骨質(zhì)較薄,基質(zhì)內(nèi)含有豐富的牙骨質(zhì)細胞??瞻讓φ战M牙槽骨和牙骨質(zhì)再生較少。3組骨缺損高度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),PDLSCs組和GMSCs組新生牙骨質(zhì)百分比、新生骨面積百分比均明顯高于空白對照組,但PDLSCs組與GMSCs組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
表1 HE染色結(jié)果分析Table 1 Analysis of HE staining resulfs
注:與空白對照組相比,①P<0.05
2.2 3組天狼星紅染色結(jié)果比較 GMSCs組:新生牙周纖維粗大,多垂直插入新生牙骨質(zhì),具備Sharpey’s纖維特征,偏振光顯微鏡下牙周韌帶纖維主要為Ⅰ型,見圖1A;PDLSCs組:與GMSCs組基本一致,見圖1B;空白對照組:新生牙周韌帶主要水平向插入新生牙骨質(zhì),不具備Sharpey’s纖維特征,偏振光顯微鏡下牙周韌帶纖維主要為Ⅰ型和Ⅲ型,見圖1C。
圖1 三組天狼星染色結(jié)果圖Figure 1 Three sets of sirius staining results
注:A.高倍偏振光顯微鏡下,牙周再生韌帶主要為橙色,且多以>60°方向插入新生牙骨質(zhì);B. 高倍偏振光顯微鏡下,牙周再生韌帶主要為橙色,且多以>60°方向插入新生牙骨質(zhì);C. 高倍偏振光顯微鏡下,牙周再生韌帶主要為橙色或綠色,且多以<60°方向插入新生牙骨質(zhì)
2.3 3組免疫組化結(jié)果比較 采用免疫組化分析檢測再生組織中GFP紅染骨細胞的表達,結(jié)果顯示GMSCs組、PDLSCs組紅染骨細胞占比接近,且均明顯高于空白對照組(P<0.05),見表2。
表2 3組免疫組化分析結(jié)果Table 2 3 sets of immunoassay resuts
注:與空白對照組相比,①P<0.05
PDLSCs是研究較廣泛的牙周再生組織工程種子細胞,已有較多研究證實了其具備良好的牙周組織再生潛能。袁萍等[5]研究顯示,PDLSCs可表達間充質(zhì)干細胞表面標志物STRO-1和CD146,且來源于牙周炎患者的PDLSCs具備更強的增殖潛能,但其成骨分化能力下降;體外培養(yǎng)鼠PDLSCs具備良好的增殖活性和礦化能力,但性能差于根尖乳頭干細胞[6-7];安康康等[8]研究顯示,PDLSCs具備良好的成骨和成脂分化能力。但該細胞來源有限,獲取困難,并不適宜于臨床大規(guī)模應用。
GMSCs同為牙周組織來源,其具備取材方便、易培養(yǎng)的優(yōu)勢,部分研究也證實其具備良好的成骨能力。研究顯示GMSCs具備良好的成骨和成脂能力,且堿性成纖維細胞生長因子能夠抑制其的成骨能力、促進其成脂能力[9-10];陳巖等[11]研究顯示GMSCs經(jīng)誘導后具備礦化能力,且根端牙胚條件培養(yǎng)液能夠誘導其分化。本研究結(jié)果與之一致,也觀察到GMSCs膜片能夠有效促進牙周組織再生。
為了有效對比觀察2種膜片移植后在生物體內(nèi)的增殖及分化情況,本研究對所移植細胞膜片進行了eGFP標記,再利用熒光顯微鏡能夠有效觀察到GMSCs和PDLSCs在體內(nèi)的增殖和分化情況。2種細胞膜片組根分叉組織缺損區(qū)均有新生牙骨質(zhì)、牙周膜和骨組織形成,而空白對照組幾乎不能觀察到上述新生組織。植入細胞膜片后,大部分新生牙槽骨在顯微鏡下呈橙色表達,這說明再生的牙周纖維主要為Ⅰ型,且天狼星紅染色顯示,可靠到多數(shù)膠原纖維垂直或接近垂直地插入新生牙骨質(zhì),而空白對照組牙周纖維束多與牙根面平行,并不具備正常功能,提示細胞膜片對新生牙周圍韌帶具有調(diào)節(jié)作用[12-14]。免疫組化結(jié)果顯示,植入細胞膜片后,大部分新生的牙周組織來源于植入的可穩(wěn)定表達GFP的干細胞,上述結(jié)論均提示GMSCs與PDLSCs一樣,能夠形成牙周膜、牙槽骨可牙骨質(zhì)。但免疫組化結(jié)果也表明,并非所有的再生組織都能表達綠色熒光蛋白,這說明機體內(nèi)源性前體細胞也參與修復了牙周缺損。由此可推測,GMSCs和PDLSCs具備2種促牙周組織再生能力,可直接分化為牙周組織,對宿主內(nèi)源性前體細胞有間接調(diào)控途徑。研究也證實PDLSCs能夠激活機體Wnt信號通路,從而調(diào)控其他細胞的分化[15-18]??傊珿MSCs與PDLSCs細胞膜片均能夠有效促進牙周再生,基于獲得方便性上進行對比,采用GMSCs更具優(yōu)勢[19-20],具備更廣泛的應用空間。
本研究顯示PDLSCs細胞膜片能夠有效促進牙周再生,但其獲得相對困難;GMSCs的促牙周再生能力于PDLSCs相近,且獲得更為方便。