解淀粉芽孢桿菌B10-26對(duì)芝麻的促生防病效果及其定殖能力分析

何碧珀 ，郝學(xué)政 ，劉紅彥 ，倪云霞 ，劉新濤 ，趙新貝 ，趙 輝*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部農(nóng)作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)廳 中藥材生產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，河南 鄭州 450002)

芝麻莖點(diǎn)枯病是由菜豆殼球孢引起的土傳病害，是危害芝麻的主要病害之一，能造成10%～20%的減產(chǎn)，重發(fā)地減產(chǎn)可達(dá)80%以上[1]。該病害在芝麻整個(gè)生長(zhǎng)期均可發(fā)生，導(dǎo)致莖稈中空、蒴果干枯，對(duì)芝麻產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。目前，芝麻莖點(diǎn)枯病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，但大量使用化學(xué)藥劑會(huì)造成病原菌抗藥性增加、環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等諸多問(wèn)題，因此，生物防治成為解決化學(xué)防治弊端的重要措施。芽孢桿菌具有良好的抗病促生作用，機(jī)制主要有營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)(定殖)作用、溶菌作用、抗生作用以及誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等，因其具有很強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，在農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用。與枯草芽孢桿菌親緣性很高的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)也能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，具有抑菌譜廣、繁殖能力和抗逆性強(qiáng)、防病促生能力好等基本特性，被廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治領(lǐng)域。李姝江等[2]研制的解淀粉芽孢桿菌BA-12可濕性粉劑對(duì)核桃根腐病有優(yōu)良防治效果；張金鳳等[3]發(fā)現(xiàn)，在棉花育苗基質(zhì)中添加解淀粉芽孢桿菌41B-1R可以有效降低黃萎病的危害。解淀粉芽孢桿菌的生防作用機(jī)制研究表明，它可以產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶、纖維素酶、吲哚-3-乙酸和脂肽類(lèi)抗生素來(lái)發(fā)揮生防作用[4-5]。本研究以芝麻菜豆殼球孢為靶標(biāo)，解淀粉芽孢桿菌B10-26為研究對(duì)象，對(duì)其促生作用、盆栽防效、定殖情況、胞外水解酶活性以及抗生素合成酶相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)定，揭示B10-26防治芝麻莖點(diǎn)枯病的生防機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B10-26在生防領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試芝麻品種：鄭芝13，由本實(shí)驗(yàn)室培育；供試拮抗菌菌株：解淀粉芽孢桿菌B10-26，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；供試真菌：菜豆殼球孢，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。供試農(nóng)藥：80%多菌靈可濕性粉劑和10億cfu/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑分別購(gòu)自蘇州遍凈植保科技有限公司和百立徳生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母浸出粉、15 g瓊脂粉、1 L蒸餾水，121 ℃滅菌30 min。

NA培養(yǎng)基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酵母浸出粉、5 g NaCl、1 L蒸餾水，121 ℃滅菌 30 min。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、10 g羧甲基纖維素鈉、15 g瓊脂、1 L蒸餾水，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

脫脂奶粉培養(yǎng)基：100 g脫脂奶粉、15 g瓊脂、1 L蒸餾水，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。

β-1,3-葡聚糖酶培養(yǎng)基：0.05 g D-葡聚糖、0.5 g 酵母提取物、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl、0.01 g剛果紅、15 g瓊脂、1 L雙蒸水，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基：取2 g幾丁質(zhì)，溶于40 mL濃鹽酸中，于4 ℃攪拌8 h后，滴加250 mL 95%的乙醇(-20 ℃預(yù)冷)，即出現(xiàn)白色膠體狀物質(zhì)。4 ℃冰箱過(guò)夜后，反復(fù)用冰冷的雙蒸水離心洗滌沉淀(5 000 r/min離心1 min)，洗至pH值5.0左右，溶于200 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH值5.0)中。10 000 r/min勻漿1 min，即成1%的膠體幾丁質(zhì)。稱(chēng)取5 g蛋白胨、2.5 g酵母粉、5 g NaCl、20 g瓊脂，加入20%膠體幾丁質(zhì)，雙蒸水定容到1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 B10-26發(fā)酵液制備

在LB平板上劃線B10-26，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于NA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h所得即為發(fā)酵原液，用血球計(jì)數(shù)板法對(duì)菌量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 B10-26菌株對(duì)芝麻的促生作用檢測(cè)

1.4.1 B10-26菌株對(duì)芝麻種子萌發(fā)的影響 采用浸種法測(cè)定B10-26發(fā)酵液對(duì)種子萌發(fā)的影響。芝麻種子依次用70%乙醇處理3 min，5%的次氯酸鈉處理3 min，無(wú)菌水漂洗4～5遍，晾干備用。將1.3中制備的5.92×109cfu/mL B10-26發(fā)酵原液分別稀釋50倍、100倍、500倍、1 000倍后，浸泡芝麻種子24 h，并以無(wú)菌水和NA培養(yǎng)基浸泡的芝麻種子為對(duì)照。每皿30粒種子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，保濕培養(yǎng)，24 h后測(cè)萌發(fā)率，以胚芽長(zhǎng)度達(dá)到種子長(zhǎng)度1/2時(shí)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，5 d后隨機(jī)選10株萌發(fā)種子測(cè)其根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。

1.4.2 B10-26菌株對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的影響 將15粒發(fā)酵液浸泡的芝麻種子種植在滅菌后的砂土(砂∶土=1∶3)中，種子消毒和發(fā)酵液浸種方法同1.4.1。20 d后選取10株芝麻幼苗測(cè)株高、根長(zhǎng)及鮮、干質(zhì)量。株高測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)為根莖結(jié)合處到生長(zhǎng)最高點(diǎn)，根長(zhǎng)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)為根莖結(jié)合處到根尖最長(zhǎng)點(diǎn)。

1.5 B10-26菌株對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病的防效檢測(cè)

選用無(wú)菌土栽培的4～6葉期芝麻幼苗，測(cè)定B10-26菌株對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病的防治效果，共設(shè)置2種處理方式，分別為：B10-26發(fā)酵液、多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑與菜豆殼球孢同時(shí)灌根處理，B10-26發(fā)酵液、多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑灌根處理7 d后再灌根接種菜豆殼球孢。菜豆殼球孢接種濃度為1×106cfu/mL，接種量為5 mL/株；B10-26發(fā)酵液濃度為1×108cfu/mL，接種量為5 mL/株。以多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑1 000倍稀釋液為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)10株。于接種菜豆殼球孢20 d后調(diào)查芝麻幼苗的發(fā)病情況。調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考高樹(shù)廣等[6]報(bào)道的芝麻苗期莖點(diǎn)枯病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.6 B10-26菌株的定殖檢測(cè)

利用利福平抗性標(biāo)記法對(duì)B10-26菌株進(jìn)行定殖檢測(cè)，參考王卿等[7]方法。挑取B10-26單菌落接種到利福平質(zhì)量濃度為 0.5 μg/mL的NA培養(yǎng)基中，待菌株穩(wěn)定生長(zhǎng)后，依次轉(zhuǎn)接到利福平質(zhì)量濃度為 10、25、50、100、200、300 μg/mL的NA培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接量為1%，誘導(dǎo)至利福平質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)結(jié)束。從含利福平300 μg/mL的B10-26菌液中取100 μL梯度稀釋后涂布于NA(利福平300 μg/mL)平板上，培養(yǎng)后挑取菌落形態(tài)、拮抗活性不變的抗利福平菌株進(jìn)行純化，得到抗利福平的菌株B10-26R并保存?zhèn)溆谩?/p>

將B10-26R接種到含利福平300 μg/mL的NA培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。取45粒消毒芝麻種子浸入1×108cfu/mL的B10-26R菌液中3 h，在超凈工作臺(tái)晾干后播種。于播種后7、12、17、22、27 d分別取根、莖、葉組織各1.0 g，先用70%乙醇處理3 min，再用0.1%的升汞處理1.5 min，然后用無(wú)菌水漂洗5遍，晾干后剪碎并加入1 mL無(wú)菌水研磨，取100 μL樣品涂布于NA(利福平300 μg/mL)平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。根據(jù)每個(gè)處理的平均菌落數(shù)分別計(jì)算每克鮮根、莖、葉中所含的菌量。

1.7 B10-26菌株胞外水解酶活性檢測(cè)

對(duì)B10-26菌株的β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶等胞外水解酶活性進(jìn)行檢測(cè)，參考Ren等[8]的方法。

1.8 B10-26菌株抗生素合成酶基因檢測(cè)

B10-26菌株基因組DNA提取采用CTAB法。聚酮類(lèi)抗生素(Bacillaene)合成酶相關(guān)基因baeB、表面活性素(Surfactin)合成酶相關(guān)基因srfAD、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)合成酶相關(guān)基因mycB、伊枯草菌素(Iturin)合成酶相關(guān)基因ituA和豐原素(Fengycin)合成酶相關(guān)基因fenB的引物和PCR反應(yīng)條件均參考鄧建良等[9]的方法。最后將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，確定抗生素合成酶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

表1和表2結(jié)果表明，B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻有一定的促生作用，其中稀釋50倍的發(fā)酵液(約1×108cfu/mL)對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響最明顯，與無(wú)菌水處理相比，芝麻種子的萌發(fā)率提高43.37%，胚根長(zhǎng)度增加49.25%，胚芽長(zhǎng)度增加23.61%；芝麻幼苗的株高增加31.75%，根長(zhǎng)增加21.43%，鮮質(zhì)量增加26.67%，干質(zhì)量提高46.51%。因此，1×108cfu/mL的B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻促生作用顯著。

2.2 B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病的防治效果

如表3所示，B10-26發(fā)酵液、多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑灌根處理芝麻苗后立即接種菜豆殼球孢，其防治效果分別為37.2%、50.8%、38.3%，B10-26發(fā)酵液的防效與枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防效相當(dāng)；而先進(jìn)行B10-26發(fā)酵液、多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑灌根處理，7 d后再灌根接種菜豆殼球孢，B10-26發(fā)酵液防治效果提高到61.1%，與枯草芽孢桿菌和多菌靈可濕性粉劑防效相當(dāng)。

表1 B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻種子萌發(fā)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

表2 B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的影響

表3 B10-26發(fā)酵液對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病的防治效果

2.3 B10-26菌株在芝麻植株上的定殖情況

2.3.1 B10-26抗利福平菌株篩選 經(jīng)過(guò)抗生素梯度誘導(dǎo)篩選，獲得1株菌落形態(tài)與原始菌株一致且對(duì)300 μg/mL利福平具有抗性的菌株B10-26R。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，B10-26R和B10-26對(duì)菜豆殼球孢的抑菌圈直徑分別為(0.65±0.036 1) cm 和(0.66±0.011 5) cm，抑菌作用差異不顯著，因此，利用B10-26R進(jìn)行定殖研究。

2.3.2 B10-26R菌株在芝麻上的定殖動(dòng)態(tài) 如圖1所示，芝麻種子經(jīng)發(fā)酵液浸種，播種后7～27 d均能從芝麻中分離出目的菌株，根和莖上的定殖動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似，定殖菌量均先升高再降低，12 d定殖菌量達(dá)到高峰，分別為6.1×104cfu/g和2.2×103cfu/g，而葉上的定殖動(dòng)態(tài)呈緩慢下降的趨勢(shì)，7 d時(shí)最大定殖菌量為3.4×102cfu/g。結(jié)果表明，菌株B10-26R能在芝麻的根、莖、葉上定殖，且27 d后未對(duì)芝麻植株造成危害。

圖1 B10-26R菌株在芝麻上的定殖動(dòng)態(tài)

2.4 B10-26菌株胞外水解酶活性分析

如圖2所示，B10-26菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和脫脂奶粉培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生透明圈，在β-1,3-葡聚糖酶培養(yǎng)基上產(chǎn)生暈圈，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，透明圈或暈圈的直徑持續(xù)增加，而在幾丁質(zhì)酶的選擇培養(yǎng)基上沒(méi)有產(chǎn)生透明圈或暈圈，說(shuō)明B10-26菌株能夠產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶，不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

1：β-1,3-葡聚糖酶培養(yǎng)基； 2：脫脂奶粉培養(yǎng)基； 3：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基； 4：幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基圖2 B10-26菌株胞外水解酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.5 B10-26菌株抗生素合成酶相關(guān)基因測(cè)定分析

以B10-26基因組DNA為模板，采用fenB、srfAD、mycB、ituA和baeB基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖3所示，擴(kuò)增出大小分別為1 400 bp、675 bp和750 bp的fenB、srfAD和baeB基因條帶，沒(méi)有擴(kuò)增出mycB和ituA基因條帶。將特異性條帶回收、克隆，并進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，B10-26的fenB基因片段序列與解淀粉芽孢桿菌Y2(NC_017912.1)和解淀粉芽孢桿菌YAU B9601-Y2(NC_017061.1)的豐原素合成酶相關(guān)基因fenB相似度達(dá)99%；srfAD基因片段序列與解淀粉芽孢桿菌 FZB42(NC_009725.1)和B9601-Y2(HE_774679.1)的表面活性素合成酶相關(guān)基因srfAD序列相似度分別為99%和100%；baeB基因片段序列與解淀粉芽孢桿菌FZB42(NC_009725.1)中的聚酮類(lèi)抗生素合成酶相關(guān)基因baeB序列相似度為99%。因此，生防菌B10-26基因組具有fenB、srfAD和baeB3個(gè)抗生素合成酶相關(guān)基因。

M：DL2000 DNA Marker； 1： fenB； 2：srfAD； 3：mycB； 4：ituA； 5：baeB圖3 B10-26菌株抗生素合成酶相關(guān)基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌主要通過(guò)提高種子萌發(fā)率、增加植物質(zhì)量和提高產(chǎn)量來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[10]。當(dāng)B10-26菌液濃度達(dá)1×108cfu/mL時(shí)，對(duì)芝麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用。防治結(jié)果表明，同時(shí)接種B10-26發(fā)酵液和菜豆殼球孢，防治效果僅為37.2%；而用B10-26發(fā)酵液灌根處理7 d 后再接種菜豆殼球孢，防治效果達(dá)到61.1%，生防效果顯著提高，推測(cè)可能是B10-26菌株在芝麻幼苗體內(nèi)定殖一定數(shù)量后，迅速占領(lǐng)病原菌與寄主植物的結(jié)合位點(diǎn)，從而對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病起到較好的防治效果。定殖能力是決定生防菌發(fā)揮穩(wěn)定生防效果的關(guān)鍵因素，表現(xiàn)為在空間上快速占領(lǐng)生態(tài)位點(diǎn)、大量繁殖和定殖，誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性，排斥、阻斷或干擾植物病原菌的侵染[11-12]。本研究利用利福平抗性標(biāo)記法檢測(cè)B10-26菌株在芝麻幼苗上的定殖數(shù)量和定殖動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，其在根部的定殖數(shù)量最多，莖部和葉部遞減，這與張彥等[13]報(bào)道的分離自土壤的蠟樣芽胞桿菌ANTI-8098A在番茄體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)結(jié)果相似。生防菌B10-26分離自土壤，但能夠在芝麻體內(nèi)定殖，符合前人關(guān)于內(nèi)生菌來(lái)源于植物體外，主要源自土壤的報(bào)道[14]。王娜等[15]也認(rèn)為，利用生防菌防治植物病害應(yīng)采取提前定殖的方式，只有當(dāng)生防菌在作物根部或莖部定殖一定數(shù)量后才能有效占據(jù)特定生態(tài)位點(diǎn)和空間，從而更有效地抑制病原菌的生長(zhǎng)，防治植物病害發(fā)生。因此，在采取提前定殖方式的條件下，B10-26菌液與多菌靈和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病具有同等的防治效果。

生防菌對(duì)植物病原真菌的溶菌作用與真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)，植物病原真菌的細(xì)胞壁成分較復(fù)雜，大多數(shù)含β-1,3-葡聚糖、纖維素、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)等，因此，需要多種酶共同作用才能降解病原真菌的細(xì)胞壁。相關(guān)研究表明，胞外水解酶如β-1,3-葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶可以降解真菌細(xì)胞壁，在植物病害防治方面起到一定作用[16]。芽孢桿菌在發(fā)揮抗生作用的過(guò)程中產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)來(lái)抑制植物病原菌，這些抗菌物質(zhì)主要分為2類(lèi)，其中一類(lèi)是具有抗真菌活性的脂肽類(lèi)抗生素，如表面活性素、伊枯草菌素、豐原素等，另一類(lèi)是具有抗細(xì)菌活性的聚酮類(lèi)抗生素和細(xì)菌素，它們均能夠破壞細(xì)胞膜的屏障功能，是芽孢桿菌抗菌防病的重要機(jī)制[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌B10-26能夠分泌β-1,3葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶等胞外水解酶，不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶；檢測(cè)到B10-26菌株基因組中存在fenB、srfAD、baeB等抗生素合成相關(guān)基因，表明B10-26菌株具有產(chǎn)豐原素和表面活性素等脂肽類(lèi)抗生素以及聚酮類(lèi)抗生素的能力，這與張華等[19]報(bào)道一致。辛雅芬等[20]也曾指出，許多細(xì)菌和真菌產(chǎn)生的胞外酶和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是抗生素，都參與了抑制植物病原菌的生防活動(dòng)。因此，推測(cè)B10-26菌株能夠產(chǎn)生胞外水解酶和抗生素，并在協(xié)同作用下使病原真菌菌絲頂端細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的張力發(fā)生不平衡，導(dǎo)致菌絲頂端膨脹、破碎，最終死亡，從而達(dá)到抑制植物病原真菌的目的。