基于高通量測(cè)序的生物炭施用量對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落的影響

任天寶，楊艷東，高衛(wèi)鍇，李宙文，閻海濤，王省偉，劉國順

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/河南省生物炭工程技術(shù)中心，河南 鄭州 450002； 2.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東 廣州 510000; 3.河南省煙草公司鄭州市公司，河南 鄭州 450000)

生物炭(Biochar)是指作物秸稈、木質(zhì)物質(zhì)、禽畜糞便等含碳量豐富的生物質(zhì)在無氧或限氧的條件下經(jīng)過高溫(350～700 ℃)熱解而形成的富含有機(jī)碳的物質(zhì)，將其施入土壤，可以增加土壤有機(jī)質(zhì)或腐殖質(zhì)的含量[1-5],進(jìn)而影響土壤的生物活性和理化性質(zhì)，如土壤pH值、陽離子交換量(CEC)、容重、孔隙度和含水量等[6-12]，這些理化性質(zhì)又將會(huì)影響微生物活性和微生物群落結(jié)構(gòu)。生物炭還具有改善微生物細(xì)胞的附著性能、促進(jìn)特定類群土壤微生物棲息和生長的作用，并且能夠改變土壤養(yǎng)分的生物有效性等。土壤微生物被視為陸地生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者，在構(gòu)建自身生物量獲取資源的同時(shí)，可促使生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流通，同時(shí)調(diào)控養(yǎng)分與碳在土壤-植物-大氣之間的平衡與循環(huán)，進(jìn)而對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。已有研究表明，生物炭可以改變土壤微生物群落組成、豐度、活性及多樣性等[13-17]。顧美英等[15]研究施用生物炭對(duì)新疆石河子墾區(qū)灰漠土和風(fēng)沙土土壤養(yǎng)分和微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后灰漠土和風(fēng)沙土根際土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量均增加,根際土壤細(xì)菌數(shù)量分別提高2.2%和72.1%，真菌數(shù)量分別提高80.0%和83.3%。陳澤斌等[16]研究生物炭不同施用量對(duì)煙草根際土壤微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，在生物炭施用量為50～150 g/棵時(shí)，隨著生物炭施用量的增加，根際土壤細(xì)菌種類的多樣性和分布的均勻程度均提高。陳懿等[17]研究表明，施用生物炭可以增加植煙土壤微生物數(shù)量。

一般而言，土壤中可進(jìn)行平板培養(yǎng)的微生物數(shù)量僅占0.1%～1.0%[18-19]，傳統(tǒng)培養(yǎng)所得到的微生物群落信息極小[20]。土壤微生物非培養(yǎng)研究方法，如DNA指紋圖譜技術(shù)、磷脂脂肪酸分析法以及微陣列基因芯片等方法雖然克服了培養(yǎng)技術(shù)的一些缺點(diǎn)[21]，但是這些方法與第2代測(cè)序方法相比，仍有通量低和信息量小的缺點(diǎn)[22]。第2代測(cè)序方法以Illumina公司的Solexa，Roche公司的454，Life Technologies公司的SOLiD、IonTorrent為主[23-24]。這些測(cè)序平臺(tái)具有快捷、價(jià)格相對(duì)較低、數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高等特點(diǎn)，在土壤微生物物種、結(jié)構(gòu)、功能和遺傳多樣性的研究中可以獲得大量的信息[25]。為此，以湘西山地植煙土壤為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為生物炭改良山地土壤生物學(xué)特性提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年2—7月在湖南永順縣松柏鎮(zhèn)廣東中煙基地單元核心示范區(qū)進(jìn)行，試驗(yàn)田地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)(108°21′～116°07′E、29°05′～33°20′N)，四季分明，雨熱同季。全年日照時(shí)間為1 100～2 150 h，年平均氣溫為15～17 ℃，無霜期為230～300 d，年降水量約為580 mm。供試土壤為黃棕壤。供試烤煙品種為K326。試驗(yàn)地土壤含堿解氮59.71 mg/kg、速效氮91.51 mg/kg、速效磷23.11 mg/kg、速效鉀157.65 mg/kg，pH值為5.4。

生物炭由河南省生物炭工程技術(shù)研究中心提供，原料為花生殼，在350 ℃條件下炭化4 h制成，其含全碳71.50%、水分9.00%、總氮1.9%、總磷3.00%、總鉀0.8%,pH值為8.5。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：OEE(原生態(tài)土壤，取自未耕作過的土地)、CK(生物炭用量為0)、T1(生物炭用量為0.75 t/hm2)、T2(生物炭用量為1.5 t/hm2)和T3(生物炭用量為2.25 t/hm2)，每個(gè)處理重復(fù)3次，小區(qū)面積為25 m2。煙苗于2月10日移栽，種植密度為16 500株/hm2，2月5日將生物炭在起壟之后施入壟臺(tái)之上，施肥方式為穴施，施肥點(diǎn)距離煙株15 cm，所有處理水肥管理與大田管理一致。

1.3 土壤樣品的采集

在烤煙采收完畢后(2016年8月5日)進(jìn)行土壤樣品(根系土)的采集。按照5點(diǎn)取樣法分小區(qū)進(jìn)行采樣。采集時(shí)先除去地面植被和枯枝落葉，鏟除1 cm左右的表土，再進(jìn)行0～20 cm耕層土壤采集，混勻后采用四分法保留1 kg土壤樣品裝入已滅菌的牛皮紙袋中，立即放入4 ℃冰盒中保存。將冷藏土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，剔除植物殘?bào)w、較大的土壤動(dòng)物及石頭等，再迅速過2 mm篩。然后在-80 ℃條件下保存，用于土壤細(xì)菌16S rDNA 序列的測(cè)序分析。

1.4 土壤總DNA的提取及16S rDNA序列測(cè)定

參照Omega公司的D5625-01 Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒的說明書提取土壤樣品DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查后，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

使用帶標(biāo)簽序列的ITS2 區(qū)及16S rDNA-V4 區(qū)特異引物3F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、4R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用KODPlus-Neo高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海美吉生物信息科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控及分析

剔除標(biāo)簽序列和引物序列，用FLASH 軟件[26]進(jìn)行序列拼接，經(jīng)Qiime軟件[27]過濾后與Gold database 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，再用UCHIME 軟件[28]去除嵌合體序列，得到有效序列。用Uparse軟件[29]在97%的相似性水平上劃分操作分類單元(OTU)，代表序列用RDP Classifier 軟件[30]和Green Gene 數(shù)據(jù)庫[31]進(jìn)行物種注釋。利用Mothur軟件作稀釋度曲線。采用R語言繪制樣品OTU的韋恩圖、PCA圖、多重比較圖和熱圖。

參考Kim等[13]的方法分析細(xì)菌Alpha多樣性，其評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括Chao1、覆蓋度和Shannon指數(shù)等。其中，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)；覆蓋度是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低；Shannon指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭施用量對(duì)湘西山地植煙土壤細(xì)菌物種組成的影響

由圖1所示，不同處理土壤樣品中公有OUT為1 483個(gè)，占總OTU數(shù)的8.69%。施用生物炭的T1、T2、T3處理與CK土壤樣品中公有OTU分別為2 773、2 556、2 734個(gè)，表明隨著生物炭施用量的增加，生物炭處理與對(duì)照處理中細(xì)菌種類的相關(guān)性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樯锾扛纳屏送寥牢锢斫Y(jié)構(gòu)和微環(huán)境，為細(xì)菌生長提供了更多的生存空間和資源，從而促進(jìn)了細(xì)菌的生長發(fā)育[32-33]。OEE土壤樣品中，與CK土壤樣品中公有的OUT占31.98%，表明長期施用化肥會(huì)對(duì)農(nóng)田細(xì)菌物種組成造成明顯影響。

圖1 不同處理土壤細(xì)菌OTU分布

2.2 生物炭施用量對(duì)湘西山地植煙土壤細(xì)菌多樣性的影響

由表1可以看出，細(xì)菌Chao1值隨生物炭施用量增加先降低后增加，與OEE相比，生物炭處理細(xì)菌Chao1值均明顯提高，但均低于CK；覆蓋度隨生物炭施用量增加先增加后降低，生物炭處理的覆蓋度均高于CK，但均低于或者等于OEE；Shannon指數(shù)隨生物炭施用量的增加先降低后增加，生物炭處理的Shannon指數(shù)均低于CK，且僅T1處理高于OEE。推測(cè)生物炭的施入可能改變了土壤的基本理化特性，提高了土壤的通透性，進(jìn)而影響了土壤中厭氧環(huán)境條件下的細(xì)菌多樣性，致使多樣性指數(shù)降低。

表1 不同處理土壤細(xì)菌Alpha多樣性

由圖2可知，主成分1(PC1)與主成分2(PC2)對(duì)土壤樣品的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到62.16%和14.41%。此外，OEE、CK土壤樣品均位于PC1的負(fù)值區(qū)域，分別位于PC2坐標(biāo)軸負(fù)、正兩側(cè)，說明這2組樣品間的主成分變異顯著；T1、T2和T3處理樣品均位于PC2坐標(biāo)軸附近，對(duì)PC2的貢獻(xiàn)表現(xiàn)為T2和T3處理間差異不明顯，但均大于T1處理，這也進(jìn)一步說明了生物炭對(duì)土壤樣品細(xì)菌群落有明顯影響。總體而言，施用生物炭影響了土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，且隨生物炭施用量的增加，該影響程度隨之增加。

圖2 不同處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

2.3 生物炭施用量對(duì)湘西山地植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，對(duì)各處理中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)進(jìn)行豐度分析表明，酸桿菌門和綠彎菌門在各處理間的群落豐度均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，而其他菌門群落豐度在各處理間差異均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。施用生物炭處理變形菌門群落豐度顯著高于OEE(P<0.05)，而這種程度隨生物炭施用量的增加而增加，與CK相比，僅T3處理的變形菌門群落豐度提高。施用生物炭處理酸桿菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加而降低，均低于OEE和CK，OEE酸桿菌門群落豐度最高。施用生物炭處理放線菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)，均高于CK、低于OEE。施用生物炭處理綠彎菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加而降低，均高于CK，僅T1處理高于OEE。施用生物炭處理芽單胞菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)，均高于OEE，T1、T3處理均高于CK。施用生物炭處理螺旋體菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，均高于OEE，僅T2處理高于CK。施用生物炭處理裝甲菌門群落豐度變化趨勢(shì)與螺旋體菌門相似，也隨生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，均高于OEE和CK。綜上，與CK相比，生物炭施入植煙土壤后，對(duì)放線菌門、綠彎菌門、裝甲菌門群落豐度有明顯的促進(jìn)作用，而對(duì)酸桿菌門群落豐度有一定的抑制作用。

圖3 不同處理土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門水平上相對(duì)豐度分析

由圖4可知，隨著生物炭施用量的增加，各處理細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成相似度增加，這表明施用生物炭可以促使細(xì)菌種群朝特定方向改變，而這種改變程度與生物炭施入量有關(guān)。OEE與其余處理的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成相似度低，生物炭處理之間細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成相似度較高，與OEE細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成相似度較低，與CK細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成相似度較OEE高,但較其余生物炭處理低，說明經(jīng)耕作后的土壤細(xì)菌群落組成會(huì)發(fā)生較大改變。各處理中變形菌門與其余菌門相似度低，而芽單胞菌門與螺旋體菌門、放線菌門與綠彎菌門的群落組成相似度較高。

用顏色梯度表示物種所占比例的大小，顏色越深說明該物種所占比例越大圖4 不同處理土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門組成及聚類分析

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，與CK相比，生物炭施入植煙土壤后，對(duì)酸桿菌門群落豐度有一定的抑制作用，這與姚欽[27]的研究結(jié)果一致，因?yàn)樯锾砍蕢A性，施入土壤中不利于酸桿菌門細(xì)菌的生長；對(duì)放線菌門、綠彎菌門、裝甲菌門群落豐度有明顯的促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)樯锾康亩嗫仔?，為?xì)菌在土壤中生長及繁殖提供了更多的空間，從而增加了細(xì)菌的數(shù)量，同時(shí)還調(diào)節(jié)了土壤環(huán)境的物理和化學(xué)性質(zhì)，影響土壤微生物生長、發(fā)育和代謝[28]。本研究通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，生物炭可以促使土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)向特定的方向發(fā)展，在這種發(fā)展的同時(shí)，相對(duì)于CK，生物炭處理的細(xì)菌多樣性有所降低，這可能是因?yàn)橥寥兰?xì)菌對(duì)土壤酸堿度和有機(jī)質(zhì)含量較敏感[29]，同時(shí)對(duì)土壤物理特性(土壤容重、含水率、溫度)依賴性也較強(qiáng)[30]。陳溫福等[31]研究表明，生物炭能夠有效增加土壤pH值，同時(shí)會(huì)增加土壤有機(jī)質(zhì)含量。王歡歡等[32]研究表明，生物炭能夠改善土壤物理特性，降低土壤容重，提高土壤孔隙度。所以，當(dāng)生物炭改變土壤基本理化性狀后，細(xì)菌為適應(yīng)土壤的改變而改變自身的群落結(jié)構(gòu)[33]，導(dǎo)致適應(yīng)性較強(qiáng)或喜好這種改變的細(xì)菌菌群得以保留和發(fā)展[34]。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于與OEE相比，生物炭處理與CK的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有著更強(qiáng)的相似性，這可能是因?yàn)镃K也是經(jīng)過人類長期改造的耕作土壤，生物炭處理也是耕作土壤，只因生物炭的近期改造不足以使土壤細(xì)菌達(dá)到原始水平，而人類改造土壤的方式具有相似性，導(dǎo)致生物炭處理與CK的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了相似性。

土壤中不同細(xì)菌門類在土壤中發(fā)揮著不同的作用，其豐度的變化可能影響土壤的生態(tài)功能。因此，在今后的研究中可以進(jìn)一步研究生物炭對(duì)功能微生物多樣性、作物抗土傳病害及碳、氮代謝途徑的影響，為農(nóng)田土壤微生態(tài)的調(diào)控和作物的生長發(fā)育提供更多理論依據(jù)。