骨關(guān)節(jié)炎基因治療的研究進(jìn)展*

顧曉東車先達(dá)李鵬翠衛(wèi)小春**

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，太原030001；2.骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030001）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種中老年人常見的骨關(guān)節(jié)疾病，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞、繼發(fā)性骨質(zhì)增生，以及軟骨下骨和關(guān)節(jié)囊及韌帶、半月板等結(jié)構(gòu)發(fā)生的病理改變[1]。早期OA可采用理療、運(yùn)動(dòng)療法等基礎(chǔ)治療，隨著病情加重，可加用藥物治療；若病情進(jìn)一步加重，在基礎(chǔ)治療和藥物治療無效時(shí)，可選擇手術(shù)治療[2]。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展及成熟，越來越多的基因被應(yīng)用到OA治療的研究中。OA基因治療是將目的基因引入關(guān)節(jié)腔中，使目的蛋白在關(guān)節(jié)腔中能夠可控、靶向并長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，從而起到保護(hù)和修復(fù)受損關(guān)節(jié)軟骨的作用[3]。本文對(duì)目前OA基因治療的相關(guān)研究做一綜述，闡述OA基因治療的研究進(jìn)展及未來研究方向。

1 OA基因治療策略

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，缺乏血管、神經(jīng)及淋巴管[4]。軟骨細(xì)胞是一種高度分化細(xì)胞，主要功能為合成和分泌軟骨基質(zhì)蛋白，維持軟骨基質(zhì)新陳代謝。細(xì)胞外基質(zhì)主要為Ⅱ型膠原、蛋白多糖和水[5]。OA發(fā)病早期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大樣改變，細(xì)胞發(fā)生凋亡及壞死，肥大軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)降解酶類，繼而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、蛋白多糖丟失，關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞[6]。這個(gè)過程中還伴有滑膜炎癥，導(dǎo)致IL-1、TNF-α等炎癥因子釋放，最終加劇關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞[7]?？傊捎陉P(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)合成和降解失衡，最終導(dǎo)致OA發(fā)生[8]。

針對(duì)上述OA發(fā)病機(jī)制，基因治療目前主要包括減輕關(guān)節(jié)炎癥、抑制軟骨基質(zhì)降解及促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成[9]。

1.1 減輕關(guān)節(jié)炎癥和抑制軟骨基質(zhì)降解

白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是OA最為重要的炎癥因子，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨合成和降解代謝失衡，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞[10]。有研究顯示，在OA發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的含量增高，OA軟骨細(xì)胞表達(dá)更多的IL-1受體[11]。白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1RA）是一種生理性的IL-1信號(hào)通路路抑制劑，可以與IL-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-1受體，但并不激活該信號(hào)通路，從而起到抑制IL-1的作用，因此可以延緩OA關(guān)節(jié)軟骨的破壞[12]。Frisbie等[13]用腺病毒載體攜帶馬IL-1RA基因，通過關(guān)節(jié)腔注射用于治療實(shí)驗(yàn)性馬OA，結(jié)果顯示，IL-1RA基因在關(guān)節(jié)腔內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)近28 d，可以有效緩解疼痛、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、延緩OA進(jìn)展。另一項(xiàng)研究采用腺相關(guān)病毒sc-rAAV2.5攜帶IL-1RA基因用于碘乙酸（mono-iodoacetate,MIA）誘導(dǎo)的大鼠OA的治療，該研究證實(shí)了病毒攜帶基因用于OA治療的安全性和有效性[14]。

NF-κB通路是主要的炎癥通路，可以被IL-1、TNF-α等炎癥因子激活，從而產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)大量細(xì)胞降解酶類、趨化因子等產(chǎn)生[15]，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥，破壞關(guān)節(jié)軟骨。因此，有研究采用腺病毒介導(dǎo)NF-κBp65特異性siRNA（Ad-siRNANF-κBp65），在大鼠OA模型中，通過關(guān)節(jié)腔注射，抑制該信號(hào)通路的激活，抑制炎癥反應(yīng)及軟骨分解酶類的產(chǎn)生，從而延緩OA關(guān)節(jié)軟骨退變[16]。

低氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF-2α）是軟骨細(xì)胞分解代謝指標(biāo)，在OA發(fā)生過程中，HIF-2α表達(dá)上調(diào)，并直接誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、ADAMTS4等基質(zhì)分解酶類產(chǎn)生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞[17]。Pi等[18]采用小鼠OA模型，通過關(guān)節(jié)腔注射Hif-2α siRNA，靶向下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中HIF-2α的表達(dá)，減少關(guān)節(jié)軟骨分解酶類的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）是最重要的軟骨降解酶類，可以降解Ⅱ型膠原及蛋白多糖，破壞關(guān)節(jié)軟骨[19]。有研究采用MMP-13條件性基因敲除（Mmp13Col2ER）小鼠，阻斷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠OA模型中，MMP-13基因敲除小鼠關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)較野生型小鼠增加，關(guān)節(jié)軟骨退變減輕[20]。

印度刺猬蛋白（Indian hedgehog,Ihh）在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在人OA關(guān)節(jié)軟骨及滑液中，Ihh的表達(dá)增加。上調(diào)的Ihh可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大樣改變，并通過刺激Ⅹ型膠原和MMP-13的合成，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解[21]。本課題組構(gòu)建Ihh條件性基因敲除（Col2a1-CreERT2，Ihhfl/fl）小鼠，采用內(nèi)側(cè)半月板切除手術(shù)制備OA模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ihh條件性基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，其關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量更高，而Ⅹ型膠原和MMP-13的含量降低，其關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度明顯降低。這表明，通過抑制軟骨細(xì)胞中的Ihh信號(hào)可以作為一種新的方式用于預(yù)防和治療OA[22]。

1.2 促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成

由于軟骨再生能力有限，因此各種促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成的生長(zhǎng)因子，如TGF-β、IGF-1被應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎治療的研究。由于TGF-β1在軟骨發(fā)育和成熟中的關(guān)鍵作用，故一直備受關(guān)注[23]。InvossaTM是由逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的TGF-β1轉(zhuǎn)染的、經(jīng)過輻照的同種異體軟骨細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染、未經(jīng)輻照的軟骨細(xì)胞以1∶3的比例混合而成，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法可以有效修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損[24,25]。Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了InvossaTM治療中重度骨關(guān)節(jié)炎的安全性和有效性，其可以有效緩解患者疼痛及改善運(yùn)動(dòng)功能[26-28]。目前該藥物在韓國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)用于中度骨關(guān)節(jié)炎的治療，Ⅲ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)在美國(guó)開始進(jìn)行[29]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）亦被用于關(guān)節(jié)炎治療的研究。在一項(xiàng)佐劑誘導(dǎo)的兔膝關(guān)節(jié)炎模型中，通過關(guān)節(jié)腔注射腺病毒介導(dǎo)的IGF-1，可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖的合成而沒有明顯的毒副作用[30]。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）能刺激軟骨細(xì)胞增殖分化，體外實(shí)驗(yàn)表明，腺病毒介導(dǎo)的bFGF可高效轉(zhuǎn)染人OA軟骨細(xì)胞。bFGF轉(zhuǎn)染后可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)增加軟骨細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的生物合成[31]；通過向兔OA模型膝關(guān)節(jié)腔注射重組腺病毒載體攜帶的bFGF，可以促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，延緩骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的破壞[32]。

2 基因治療遞送系統(tǒng)

關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)致密，軟骨細(xì)胞被大量細(xì)胞外基質(zhì)包裹，因此各種遞送系統(tǒng)必須能夠穿過致密的關(guān)節(jié)軟骨，將目的基因?qū)腙P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，起到治療作用。目前最常用的載體有兩種：病毒載體及非病毒載體[33]。

2.1 病毒載體

病毒載體是目前基因治療最常用的遞送系統(tǒng)，常用的病毒有腺病毒、慢病毒及腺相關(guān)病毒。

腺病毒（adenovirus）在體外對(duì)軟骨細(xì)胞有接近100%的轉(zhuǎn)染效率[34]，但腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染可以引起較為強(qiáng)烈的機(jī)體免疫反應(yīng)，目的基因表達(dá)時(shí)間也較短，只有1～2周[35]。第三代腺病毒載體的出現(xiàn)克服了上述問題。有研究采用第三代腺病毒載體行小鼠膝關(guān)節(jié)腔注射，目的基因在關(guān)節(jié)內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)一年，采用第三代腺病毒載體攜帶PRG4基因治療小鼠交叉韌帶切斷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎，單次注射就可以有效抑制關(guān)節(jié)軟骨降解[36]。

慢病毒載體是由人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）改造而來，可以感染分裂及非分裂細(xì)胞，能夠插入宿主基因組，使目的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，對(duì)軟骨細(xì)胞有高達(dá)95%的轉(zhuǎn)染效率[37]。但由于慢病毒可以插入到宿主基因組中，因此可能有致瘤效應(yīng)及引起宿主基因突變。同時(shí)，由于其由HIV病毒改造而來，可能會(huì)帶來不良的心理問題[33]。

重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adeno-associated virus,rAAV）：由于移除了所有病毒編碼序列，和腺病毒相比，其免疫原性低，可感染分裂及非分裂細(xì)胞，穿過致密的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，對(duì)軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)95%，表達(dá)時(shí)間可達(dá)150 d[33,38]。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用rAAV攜帶目的基因治療骨關(guān)節(jié)炎，證明了其較高的關(guān)節(jié)軟骨轉(zhuǎn)染效率、安全性和有效性[39,40]。

2.2 非病毒載體

非病毒載體常用的有質(zhì)粒、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、基因槍技術(shù)等，通常用于體外軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染，但其轉(zhuǎn)染效率低，且不能成功用于體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨基因轉(zhuǎn)染[33]。本實(shí)驗(yàn)室采用一種新的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle,LNP）-siRNA遞送系統(tǒng)用于骨關(guān)節(jié)治療的研究。LNP系統(tǒng)是利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹siRNA，通過細(xì)胞胞吞作用，將siRNA遞送到軟骨細(xì)胞內(nèi)。研究結(jié)果表明，在體外LNP-siRNA可以轉(zhuǎn)染100%軟骨細(xì)胞。體內(nèi)結(jié)果表明LNP可以特異性地轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)軟骨組織，并不轉(zhuǎn)染滑膜。在OA大鼠模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射LNP-Ihh siRNA可延緩OA進(jìn)展[41]。該技術(shù)不僅有可能突破在體遞送siRNA至軟骨細(xì)胞的瓶頸，而且還可以廣泛應(yīng)用于其他關(guān)節(jié)疾病的基因靶向治療中。

3 MicroRNAs

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，由20～25個(gè)核苷酸組成。作為轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子，與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region,3’UTR）作用，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別mRNA，但miRNAs和其潛在的目標(biāo)靶之間并非完全互補(bǔ)，根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC）降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[42,43]。有 30 余種 miRNAs，包括 miR-455s[44]、miR-145[45,46]、miR-27b[47]、miR-146a[48]、miR-199a[49]在人類骨關(guān)節(jié)炎樣本中異常表達(dá)，表明這些miRNAs在人類骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

miR-140在成人關(guān)節(jié)軟骨中高表達(dá)，OA時(shí)其表達(dá)降低，用IL-1β處理體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，miR-140的表達(dá)下調(diào)。而在IL-1β作用的軟骨細(xì)胞中過表達(dá)miR-140，炎癥因子IL-1β、IL-6，以及軟骨分解代謝因子ADAMTS4的表達(dá)下調(diào)，而合成代謝指標(biāo)糖胺多糖和SOX-9的表達(dá)上調(diào)[50]。有研究采用慢病毒載體介導(dǎo)miR-140行關(guān)節(jié)腔注射用于大鼠實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，結(jié)果表明，miR-140關(guān)節(jié)腔注射后可以減輕滑膜炎癥，減少新生血管形成及關(guān)節(jié)軟骨破壞[51]。同樣，給予大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型關(guān)節(jié)腔注射miR-140，可以通過調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的代謝，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用[52]。

除了miR-140，其他miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是骨關(guān)節(jié)炎重要的致炎因子，研究顯示，miR-142-3p可以抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡，通過關(guān)節(jié)腔注射慢病毒過表達(dá)miR-142-3p可以阻斷小鼠骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[53]。死亡受體6（DR6）屬于腫瘤壞死因子受體超家族，可以引起細(xì)胞凋亡及激活NF-κB信號(hào)通路[54]。同樣，通過大鼠關(guān)節(jié)腔注射慢病毒載體過表達(dá)miR-210，可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，抑制NF-κB及DR6的表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)炎癥，延緩骨關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展[55]。

然而，并不是所有miRNAs對(duì)骨關(guān)節(jié)炎都是正性保護(hù)作用。有研究顯示，miR-483-5p在人骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及大鼠OA模型軟骨中表達(dá)上調(diào)，通過慢病毒介導(dǎo)miR-483-5p關(guān)節(jié)腔注射上調(diào)其表達(dá)，可加重骨關(guān)節(jié)炎病理變化，而通過關(guān)節(jié)腔注射antago-miR-483-5p沉默內(nèi)源性miR-483-5p的表達(dá)，骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度減輕[56]。

由于miRNAs可以同時(shí)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，且在OA的發(fā)生發(fā)展的不同時(shí)期，有不同的miRNAs參與疾病的進(jìn)程，因此同一種miRNA在OA中的表達(dá)，不同的研究可能會(huì)有不同的結(jié)論。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146在OA關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)上調(diào)[57]，而另一研究則得出相反的結(jié)論[58]。因此，需要進(jìn)行更加深入的研究，進(jìn)一步明確miRNAs在OA發(fā)生發(fā)展中的作用，為人類預(yù)防或延緩OA進(jìn)程提供新的手段。

4 總結(jié)與展望

基因轉(zhuǎn)染為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的方式，已有多項(xiàng)小動(dòng)物和大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其安全性和有效性，但由于病毒載體潛在的致瘤性等安全問題及非病毒載體較低的軟骨轉(zhuǎn)染效率，限制了其應(yīng)用于臨床，基因治療應(yīng)用于人體還需要更多的臨床前研究。第一種骨關(guān)節(jié)炎基因治療產(chǎn)品InvossaTM在韓國(guó)已被批準(zhǔn)用于中度骨關(guān)節(jié)炎的治療，Ⅲ期臨床試驗(yàn)已在美國(guó)開始進(jìn)行，這為骨關(guān)節(jié)炎的基因治療提供了廣闊的前景。如何使基因治療可控，安全有效，并針對(duì)特定的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，需要進(jìn)一步的深入研究。