單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標記在小麥遺傳育種中的研究進展

吳 澎，劉 娟，田紀春

（1山東農(nóng)業(yè)大學食品學院/山東省高校食品加工技術與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安271018；2山東農(nóng)業(yè)大學小麥品質(zhì)育種研究室/山東省作物生物學重點實驗室，山東泰安271018）

0 引言

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因中的某個堿基對出現(xiàn)替換、缺失或者增添而引起的堿基序列發(fā)生改變最終導致DNA序列的多樣性，其中某一等位基因的突變頻率應大于1%。SNP在基因組中分布廣泛，平均每數(shù)百bp就存在一個SNP[1]。相較于其他的重復序列，SNP在定位目標基因、構(gòu)建高密度遺傳圖譜和群體結(jié)構(gòu)分類等方面，具有更大的使用價值和發(fā)展空間。隨著SNP分析檢測手段的迅猛發(fā)展，尤其是與芯片技術和基因克隆的結(jié)合，使其成為繼RFLP和SSR等標記之后最具有發(fā)展?jié)摿Φ牡谌肿訕擞沎2]。

近年來，結(jié)合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術和高效農(nóng)藥的應用，作物育種技術在提高作物農(nóng)產(chǎn)量等方面取得較大的成功，但依然面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐發(fā)生改變，這就需要開發(fā)具有特定農(nóng)藝性狀的作物；其次，種植環(huán)境也在發(fā)生變化，使得作物需要適應不斷變化的生長條件；最后，消費者的需求發(fā)生變化。因此，需要不斷培育新品種來滿足市場的不同需求。小麥是中國重要的糧食作物，其面制品更是中國北方人民的主食[3-5]。隨著生活水平的提高，人們對面制品的要求已從滿足溫飽上升到具備良好感官品質(zhì)。而獲得優(yōu)質(zhì)面制品的基礎是高品質(zhì)的原料。因此，加強小麥等多倍體作物的SNP研究，不僅可應用于遺傳選擇育種技術培育高產(chǎn)量、抗病等小麥品種，還可用于培育制作高檔面制品的特定小麥品種。本研究擬就SNP的特點與檢測方法做簡單概括，同時對近幾年來SNP在小麥作物中的應用進行綜述和展望，以便育種工作者以及研究者們能對SNP在小麥作物上的應用有全面的了解，根據(jù)實際情況進行相應的育種工作，并為SNP標記在面制品中的研究應用奠定基礎。

1 SNP的特點

近年來，人們對SNP的研究力度、范圍都在逐漸擴大，從對人類和動物基因的研究擴展到對農(nóng)作物的研究，從二倍體作物基因的研究擴展到多倍體作物研究。顯然，SNP已經(jīng)成為了基因研究的前沿方法，這是因為與傳統(tǒng)標記相比SNP標記有其獨特的優(yōu)點。

1.1 位點多，分布廣

SNP在基因組中的密度較SSR等標記高，且數(shù)量多、分布廣，可以在待測基因的附近或內(nèi)部提供一系列的標記。Nasu等[6]分析比較了5個不同水稻品種之間SNP的頻率，結(jié)果得到在水稻基因組中每232個堿基就會存在1個SNP。此外，前人的研究表明，在大豆基因組中，平均272個堿基存在1個SNP位點[7]。在玉米基因組中，平均57個堿基存在1個SNP[8]。而Lammer等[9]通過對5個大麥品系的54個基因進行研究，發(fā)現(xiàn)大麥的38個基因中共存在112個SNP。

1.2 易實現(xiàn)分析的自動化

第三代SNP標記擺脫了傳統(tǒng)分子標記需要的耗時長且價格較貴的電泳檢測的步驟，實現(xiàn)了檢測的自動化，其檢出率也有大幅度的提高。此外，SNP通常由一對等位基因組成，又稱二等位基因標記[10]，特點為在分析時只需對二等位基因即+/-進行分析，省略了對基因片段長度的分析，從而使得SNP標記更易于實現(xiàn)檢測的自動化[11]。

1.3 具有較高的穩(wěn)定性

SNP多發(fā)生在堿基C和T之間，且兩者比例為1:2。在生物基因組中，CpG二核苷酸的胞嘧啶極易自發(fā)的脫去氨基從而形成胸腺嘧啶，這一過程也被稱為甲基化[12]，在生物基因組中發(fā)生率較高。與串聯(lián)重復微衛(wèi)星等標記相比，SNP標記由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際后兩種情況出現(xiàn)的幾率很小，常常被忽略[13]。相比于其他分子標記，SNP標記為單核苷酸的突變，且突變頻率很低，與一些不良性狀也不存在連鎖遺傳，因此屬于可遺傳的變異，遺傳穩(wěn)定性高。

1.4 代表性強

位于基因組內(nèi)部的某些SNP位點可能會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達水平產(chǎn)生直接的影響。因而或許會代表著疾病遺傳中的一些作用因素。

2 SNP的檢測方法

開發(fā)和利用SNP首先得檢測到和發(fā)現(xiàn)SNP。目前，SNP的檢測方法已比較完善，本研究就DNA構(gòu)象法、高分辨溶解曲線和直接測序法進行概括。

2.1 DNA構(gòu)象法

目前，根據(jù)DNA構(gòu)象檢測SNP的方法主要有：（1）變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，該法的優(yōu)點為檢出率高，即使只有一個堿基的改變也會被檢測出，但其變性條件的優(yōu)化和電泳時間需耗費大量時間和人力，且需要特殊的設備和昂貴的試劑，成本高；（2）變性高效液相色譜技術(denaturing high performance liquid chromatogra phy，DHPLC)，該方法具有很高的靈敏度。通常，熒光測序只能對頻率在10%以上的SNP進行檢測[14]。而DHPLC對頻率5%以下的SNP位點也非常有效；（3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformation polymorphism，SSCP)，該法有適用面廣，操作簡單方便且費用低的優(yōu)點，對150～450 bp的DNA片段進行SNP檢測時，其檢出率可達90%。但許多因素都會影響SSCP檢測的靈敏度，穩(wěn)定性不高。

2.2 高分辨溶解曲線(HRM)法

HRM是由Idaho科技公司和猶他大學共同開發(fā)的一種檢測SNP位點的新手段，目前，HRM在檢測方法方面的不斷更新進步，使其已經(jīng)成為檢測SNP位點的一項應用較廣泛的技術。其原理為，當核苷酸的性質(zhì)發(fā)生改變，DNA雙鏈熔解曲線也會有相應的改變，具體過程為將飽和熒光染料在PCR反應時加入，待其嵌入到DNA雙鏈中，在DNA雙鏈解旋時，其上的熒光信號會被儀器收集，得到熔解曲線。若DNA序列中的堿基發(fā)生突變，熔解曲線形狀和Tm值也會發(fā)生相應的改變，再利用相關軟件對其進行分析[15]。在HRM的檢測過程中，熒光染料對檢測的精確性和分辨率有重要影響，SYT09和ResoLight作為比較先進的熒光染料，與DNA有更好的結(jié)合能力，可避免解旋過程中的重排現(xiàn)象，更加準確的體現(xiàn)出DNA的解旋情況，從而提高了檢測的特異性和靈敏度。

2.3 直接測序法

直接測序法是目前檢測SNP的最可靠直接的方法，其檢出率可高達100%。如taqman[16]、微測序(SNaPshot)[17]以及焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術。此方法通過對不同樣本中的基因片段或同一基因的PCR擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果進行對比或重測序分析已定位的表達序列標簽(EST)及序列標簽位點(STS)來檢測SNP。測序時可先將擴增的PCR產(chǎn)物純化回收然后再將其連接到載體上，也可對PCR產(chǎn)物進行直接測序。通過對檢測到的序列進行比對可得到發(fā)生突變的SNP位點及其突變類型。目前，該方法在人類基因檢測中的應用已比較成熟，為人類高密度SNP圖譜的建立奠定了基礎。

直接測序主要用于SNP位點的分型及檢測，雖然測序自動化程度的提高帶來測序成本的降低，但目前直接測序法的檢測的費用依然比較高，且其對雜合體不易分型，這導致直接測序法在SNP檢測中的應用受到限制。雖然測序自動化程度的提高帶來測序成本的降低，但當前直接測序的成本還比較高，而且很難區(qū)分雜合子，這導致直接測序在SNP中的應用受到限制。

3 SNP在小麥遺傳育種中的應用

3.1 構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖

高密度遺傳連鎖圖的構(gòu)建有利于對基因進行精細的定位，圖譜中標記密度越大，其實效性也會越大，其不僅對小麥基因組分析和表型變異的研究有重要作用，也會給物種資源的鑒定帶來新的消息[18-19]。

在近幾年的遺傳圖譜的研究中，Colasuonno等[20]利用硬粒小麥的重組自交系構(gòu)建了包含467個DArT、5019個SNP、182個SSR標記的遺傳連鎖圖譜，并定位了7個與色黃素含量有關的QTL；田在民等[21]以289個小麥群體為試驗材料，構(gòu)建了覆蓋長度為2749.2 cM，覆蓋范圍分布在小麥的19個連鎖群，且標記之間平均遺傳距離為17.4 cM的遺傳連鎖圖譜；Allen等[22]對全世界內(nèi)的5個小麥群體的SNP位點進行篩選，構(gòu)建了包括225001個標記的遺傳連鎖圖譜；Maria等[23]以136個硬粒小麥品種的重組自交系為材料，得到9040個SNP標記，構(gòu)建了覆蓋基因組長度2879.3 cM的小麥遺傳連鎖圖譜；同時，檢測新手段DNA芯片技術的運用也給檢測工作帶來許多便利，Raz等[24]對硬粒小麥和野生二粒小麥雜交構(gòu)建的140株RILs進行90K iSelect SNP全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)14088個SNPs位點，14個連鎖群，構(gòu)建了全長為2110 cM的遺傳圖譜；Stuart等[25]對384HT系列硬質(zhì)小麥群體進行研究，構(gòu)建了包含1345個SNP標記的復合遺傳圖譜，并發(fā)現(xiàn)了6個與胚芽鞘長度有關的QTL。

3.2 分子標記輔助選擇育種

作物目標性狀相關的分子標記的獲得可提高育種的可預測性和選擇性，從而在選育新品種時有更加客觀的判斷。與其他分子標記相比，SNP標記在數(shù)量和分布上都有明顯優(yōu)勢，這使其在標記輔助選擇(MAS)育種中擁有更大的潛力[26]。

Liu等[27]利用高密度的90K和600K SNP檢測技術對小麥黑點病進行研究，檢測到18個新的與黑點病相關位點，分布于小麥的14條染色體上；Tan等[28]通過對252個小麥品種抗幼蟲基因的研究，發(fā)現(xiàn)位于7A染色體上5’端的第142個SNP位點對幼蟲抵抗力有較顯著的影響；Lin等[29]以155個易提前發(fā)芽和抗提前發(fā)芽小麥品種的子一代為試驗材料，利用同樣的方法研究小麥提前發(fā)芽和種子休眠有關的基因位點。結(jié)果檢測到位于4A染色體上的GBS109947和GBS212432位點分別與小麥提前發(fā)芽和種子休眠性狀密切相關；此外，Gao等[30]利用SNP標記對小麥抗莖銹病基因進行研究，發(fā)現(xiàn)了10個與抗莖銹病基因Sr42有密切關聯(lián)的位點；禹文龍等[31]利用90K SNP芯片對121個小麥品種鹽脅迫下小麥根鮮重、莖鮮重等6個性狀進行研究，結(jié)果共檢測到與6個性狀相關的耐鹽QTL 47個。

3.3 全基因組關聯(lián)分析

全基因組關聯(lián)分析是通過利用表型性狀和基因本身或基因附近微小區(qū)域的分子標記的關聯(lián)來實現(xiàn)基因的精細定位[32-33]。其所定位的QTL解析率較高，可提高MAS選擇的目的性和準確性，從而提高育種的效率[34]。

Sivakumar等[35]利用90K SNP芯片對287個小麥材料進行全基因組掃描。檢測到1個與粒重有關的位點，位于6A染色體上；4個與苗穗數(shù)有關的位點，分別位于3B、5B、5A和6A染色體上；5個與成熟期有關的位點，位于2B、3B、4D、4B和6A染色體上；Liu等[36]對歐洲的232個小麥品種的抗條紋銹病進行研究，利用SNP標記技術對試驗材料進行全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)了82個與幼苗株銹病相關的位點；周秀文[37]以134個小麥群體為研究對象，設置苗期，成熟期兩個時期，3個氮濃度處理。通過基因與性狀間的關聯(lián)分析，得到與苗期氮效率相關的分子標記2278個，與成熟期氮效率相關的標記3051個；Jighly等[38]利用SNP和DarT標記對200個小麥品種進行全基因組關聯(lián)分析，檢測到與小麥抗條繡病相關位點41個。其中，與小麥成熟期抗條繡病有關位點位于3BS、3BL、5BL、6AL和7DS染色體上，與小麥幼期抗條繡病有關位點位于3AS、3AL、1AL、2AL和2BS染色體上；Chen[39]利用SNP標記對205份小麥品種進行全基因組關聯(lián)分析，得到271個與千粒重等特征相關的標記。

3.4 在遺傳分析和物種進化中的應用

通過對小麥基因中存在的SNP進行比較分析，可獲得栽培品種與野生祖先種或野生近緣種間基因組水平上的DNA多態(tài)性信息，從而有利于促進群體結(jié)構(gòu)分類、遺傳多樣性的研究以及不同小麥群體分化特點的分析[40-42]。

Mangini等[43]利用SNP標記對3種硬質(zhì)小麥San Pasquale、Grano Ricco和Dauno3和普通小麥的基因進行研究，發(fā)現(xiàn)San Pasquale和Dauno3小麥與地中海小麥的基因有很大的相似性，Grano Ricco小麥與意大利南部小麥基因存在相似性，但與San Pasquale和Dauno3小麥的基因有較大差異；Ren等[44]利用SNP標記技術對世界各地的150個硬粒小麥的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗材料的遺傳結(jié)構(gòu)受環(huán)境條件、育種方法、基因漂移以及人類活動等因素的影響較大，來自于南北美洲、歐洲的試驗品種的遺傳基礎較寬，遺傳多樣性高；曹延杰等[45]利用90K SNP技術對96個試驗品種的基因進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間親緣關系較近，遺傳相似系數(shù)處于0.652～0.872之間，并可將其劃分為7個類群。劉進英等[46]對9份不同休眠特性的小麥種子TaGAMy-B基因的全長序列進行測定，將拼接得到的全長序列與已知TaGAMy-B基因序列進行比對分析，得到兩個新的等位變異基因，將其命名為TaGAMb-Ba和TaGAMyb-Bb。

4 展望

隨著生物技術的發(fā)展，SNP標記作為新興的第三代分子標記以其位點多分布廣、穩(wěn)定性高加上代表性強的特點彌補了第一代和第二代分子標記的缺陷，同時，第三代分子測序技術的應用及SNPs分析和檢測技術的不斷完善，特別是與DNA微陣列和芯片技術的結(jié)合，使得實驗結(jié)果更為可靠。為了使SNP標記技術更好的應用于作物育種，應該繼續(xù)推進SNP標記的研究：（1）為加強檢測的準確性和快速性，未來將開發(fā)出不同作物的高通量SNP芯片，更多的SNP也會被發(fā)掘出并通過數(shù)據(jù)庫在全球范圍內(nèi)進行共享。對作物SNP的研究將會從過去的低通量化、針對個別基因向高通量化、全基因組發(fā)展。（2）SNP分子標記技術在小麥遺傳育種中的應用已比較廣泛，利用分子標記技術對小麥農(nóng)藝性狀進行研究，可在早期通過標記篩選優(yōu)良性狀基因，從而實現(xiàn)縮短育種年限、增加作物產(chǎn)量等目標。（3）盡管當前小麥作物SNP標記技術的研究已有一定的進展，但對小麥類產(chǎn)品如饅頭、面條等感官性狀（如白度、咀嚼性與彈性等）的研究還未見報道。鑒于面制品在中國消費量巨大，可利用SNP標記技術和基因工程技術，將多個優(yōu)質(zhì)感官性狀基因聚合到一個小麥新品種上，培育具有良好面制品特性的小麥新品種。