人食管下括約肌G蛋白耦聯(lián)受體的表達(dá)及作用機(jī)制

張珂 張聰 高靜 王海辰 韓彩娜 張微 劉俊峰

食管下括約肌(lower esophageal sphincter，LES)的位置大致在食管胃結(jié)合部，而與其他哺乳動(dòng)物不同的是人食管下端寬約3 cm的環(huán)形增厚平滑肌束，包含有兩種肌纖維，即靠近胃小彎一側(cè)的勾狀纖維肌束(clasp fibre)和靠近胃大彎一側(cè)的套索纖維肌束(sling fibre)。最初結(jié)構(gòu)成分特征由Allgower等于1979年首次報(bào)道。目前多數(shù)學(xué)者通過大量解剖研究對(duì)于兩種纖維束結(jié)構(gòu)特征的共識(shí)是，鉤狀纖維形狀為半環(huán)形，套索纖維斜行走行[1]。通過多種神經(jīng)、體液因素調(diào)節(jié)，兩種肌纖維同膈肌腳共同形成了食管下高壓帶(high-pressure zone，HPZ)這一生理抗反流解剖結(jié)構(gòu)，具有防止食管—胃反流發(fā)生的生理功能。

目前認(rèn)為人LES的功能受三種機(jī)制共同調(diào)節(jié)。

第一是神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，人腦接受到刺激信號(hào)后進(jìn)行信息整合分析，然后將信息傳至迷走神經(jīng)背核神經(jīng)元胞體，經(jīng)過進(jìn)一步分析整合后再通過迷走神經(jīng)的末梢將神經(jīng)刺激傳遞到人食管下括約肌。興奮性和抑制性傳導(dǎo)通路末梢均與LES肌層內(nèi)腸道運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(enteric motor neurons，EMN)形成突觸連接，共同調(diào)節(jié)人LES的收縮與舒張[2-3]。

第二是人LES自身調(diào)節(jié)機(jī)制，也稱為肌源性調(diào)節(jié)機(jī)制。是人LES肌層中神經(jīng)細(xì)胞叢和神經(jīng)纖維網(wǎng)共同調(diào)節(jié)而形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。這種調(diào)節(jié)機(jī)制是通過對(duì)離體肌條靜息張力的研究發(fā)現(xiàn)的。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌條的部分靜息張力不能被河豚毒(tetrodotoxin，TTX)作用后消除，只可以被硝普鈉所消除。該實(shí)驗(yàn)表明靜息長(zhǎng)度張力效應(yīng)是人LES的自身調(diào)節(jié)機(jī)制作用所產(chǎn)生。

人LES除受神經(jīng)刺激調(diào)節(jié)和自身調(diào)節(jié)控制以外，第三個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素就是體液調(diào)節(jié)機(jī)制。在人LES上體液調(diào)節(jié)主要是通過激素配體與G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮作用的。因此，全面掌握人LES上G蛋白耦聯(lián)受體的表達(dá)量和表達(dá)類型，并進(jìn)一步明確G蛋白耦聯(lián)受體激動(dòng)或拮抗后的平滑肌行為對(duì)于研究食管動(dòng)力性疾病尤為重要[4]。

一、G蛋白耦聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)

跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有三類主要方式：①特殊刺激激活通道蛋白質(zhì)完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；②G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；③受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制由G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)介導(dǎo)，其胞內(nèi)的G蛋白(G-protein/GTP binding protein)，又稱鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(guanine nucleotide-Binding protein)，是細(xì)胞膜表面上的蛋白質(zhì)，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞跨膜信息傳遞系統(tǒng)的起始端，幾乎全部多肽類激素配體是通過與G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合后，在突觸后細(xì)胞中生成第二信使再經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的。另外一些激活的G蛋白耦聯(lián)受體可調(diào)控一些通道狀態(tài)。

1.結(jié)構(gòu)：G蛋白耦聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)為膜內(nèi)在蛋白(integral membrane protein)，每個(gè)受體有7個(gè)跨膜α螺旋的結(jié)構(gòu)域。當(dāng)膜外結(jié)構(gòu)與配體結(jié)合后，膜內(nèi)部分發(fā)生構(gòu)象變化，G蛋白結(jié)合位點(diǎn)與G蛋白相互作用以實(shí)現(xiàn)胞外信息向胞內(nèi)信息的傳遞。G蛋白是胞質(zhì)側(cè)膜蛋白，其與膜受體耦聯(lián)的部分通常由3個(gè)亞基組成異源三聚體。其中包含45 000的α亞基、35 000 的β亞基和70 000的γ亞基，總分子質(zhì)量為100 000左右。α亞基為催化作用單元，當(dāng)G蛋白處于失活狀態(tài)，α亞基結(jié)合一個(gè)分子的GDP；當(dāng)受體蛋白激活后G蛋白α亞基和GDP分離，再與一分子GTP結(jié)合。這時(shí)結(jié)合GTP的α亞基同β、γ亞基分離，G蛋白各亞基處于激活狀態(tài)，對(duì)膜結(jié)構(gòu)的效應(yīng)酶起作用。效應(yīng)酶抑制或激活使胞質(zhì)中第二信使生成減少或增加以實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由此可知，G蛋白有兩種狀態(tài)，即結(jié)合GDP的αβγ三聚體非活化型狀態(tài)和α亞基-GTP、β、γ亞基的活化型狀態(tài)。G蛋白是一個(gè)超級(jí)家族(GTP-binding protein superfamily)，均包含有異源三聚體和小G蛋白。作為受鳥嘌呤核苷酸調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，三聚體分子量大；小G蛋白分子量在20 000～30 000水平，相對(duì)較小且為單體，其與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間聯(lián)系目前尚未發(fā)現(xiàn)[5-6]

2.分類：三個(gè)主要類型為刺激型G蛋白(stimulatory G protein，Gs)、抑制型G蛋白(inhibitory G protein, Gi)和磷脂酶C型G蛋(PI-PLC-G protein，Gp)。不同類型的G蛋白能與相應(yīng)的效應(yīng)酶特異性耦聯(lián)以實(shí)現(xiàn)不同效應(yīng)。G蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，其通過氨基酸殘基脂化修飾以錨定在胞膜上。在各種G蛋白亞基中，Linder、Hepler等建議以差別最大的α亞基分類作為G蛋白分類依據(jù)。目前通常結(jié)合氨基酸序列、G蛋白結(jié)構(gòu)、功能性和進(jìn)化相似性等幾個(gè)方面綜合判斷作為分類依據(jù)，主要分為4類G蛋白。其中至少分別存在21、5和8種不同的α、β、γ亞基。α螺旋鏈主要有αs、αi、αo、αt1、αt2五種類型。cDNA克隆可發(fā)現(xiàn)5條α鏈的原始序列[6-8]。

二、G蛋白耦聯(lián)受體的功能

不同類型的α亞基均有鳥嘌呤核苷酸結(jié)合區(qū)，其可與GTP或GDP結(jié)合。與鳥嘌呤核苷酸(GTP、GDP)的結(jié)合可逆，使G蛋白在G蛋白耦聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮“開關(guān)”作用。跨膜信息傳遞有如下步驟：①胞外無(wú)刺激信號(hào)或配體時(shí)G蛋白處異源性三聚體形式失活狀態(tài)存在。α亞基與GDP緊密結(jié)合，β、γ亞基則與α亞基-GDP疏松結(jié)合。②外部存在刺激時(shí)受體與配體結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致G蛋白α亞基變化，使得三個(gè)亞基緊密結(jié)合為αβγ復(fù)合物，使GDP與GTP交換。與GTP結(jié)合后α亞基與β、γ亞基分離，轉(zhuǎn)化為α亞基-GTP激活態(tài)作用于效應(yīng)器，繼而出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞生理變化。③G蛋白α亞基在Mg離子存在時(shí)具有GTP水解酶活性，水解后α亞基-GDP再次與β、γ亞基結(jié)合重新恢復(fù)失活態(tài)。上述過程往復(fù)循環(huán)實(shí)現(xiàn)信號(hào)跨膜傳遞，α亞基的GTPase活性高低決定了激活狀態(tài)持續(xù)時(shí)間，進(jìn)而說(shuō)明了G蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程至關(guān)重要。G蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路多數(shù)為cAMP和磷脂酰肌醇信號(hào)通路。也有研究證實(shí)，G蛋白同時(shí)參與磷脂代謝的生理過程和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中G蛋白有信號(hào)放大和分子開關(guān)兩個(gè)主要作用。①通常一個(gè)受體可以級(jí)聯(lián)放大激活許多G蛋白實(shí)現(xiàn)跨膜傳遞信息；此外，有時(shí)細(xì)胞外配體與受體結(jié)合短暫，難以形成足夠的放大作用。而胞內(nèi)G蛋白激活時(shí)間可持續(xù)10～15 s，受體配體已經(jīng)分離時(shí)G蛋白仍處于向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的激活狀態(tài)。②G蛋白與GTP的結(jié)合啟動(dòng)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此其具有分子開關(guān)作用。此外，G蛋白的共價(jià)修飾及其濃度變化同樣會(huì)改變受體、酶間耦聯(lián)的有效性。例如，百日咳毒素催化Gi的α亞基ADP核糖基化而降低了GTP-Gi結(jié)合力，使Giα亞基不能活化，從而使腺苷酸環(huán)化酶保持活化狀態(tài)。正常生理時(shí)，G蛋白與GTP、GDP結(jié)合狀態(tài)可逆，使信號(hào)精確、適度地瞬間內(nèi)傳遞，而不是持續(xù)存在，正負(fù)反饋機(jī)制一旦被破壞細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)功能障礙。因此G蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的放大作用需要控制，不能無(wú)限放大，進(jìn)一步體現(xiàn)了G蛋白的分子開關(guān)作用。另外，G蛋白也可誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。

三、G蛋白耦聯(lián)受體的主要效應(yīng)器

1.腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)是研究最早、最多的G蛋白調(diào)節(jié)效應(yīng)器之一。受體激活后催化與Gs結(jié)合的GDP替換為GTP，導(dǎo)致Gs的α亞基與β、γ亞基分離并釋放出AS-GTP活化腺苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。腺苷酸環(huán)化酶被Gs激活，被Gi抑制。

2.磷脂酶C是G蛋白的直接效應(yīng)器，有4個(gè)同工酶。5-羥色胺等激素配體與受體結(jié)合后經(jīng)GPLC蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)可激活磷脂酶C。而磷脂酶C可催化胞質(zhì)側(cè)磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2]水解產(chǎn)生二酰甘油(diacylglycerol，DG)與肌醇三磷酸(inositol triphosphate，IP3)。DG與IP3都是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使。其中IP3可進(jìn)入胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)使Ca2+離子大量釋放到胞質(zhì)中。IP3也可增強(qiáng)胞膜對(duì)Ca2+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)促使Ca2+離子內(nèi)流以提高胞質(zhì)內(nèi)Ca2+離子濃度。其還可激活依賴Ca2+-CaM的蛋白激酶(PK)，通過Ca2+-CaM蛋白激酶催化蛋白質(zhì)磷酸化表現(xiàn)不同的效應(yīng)。但I(xiàn)P3的壽命僅數(shù)秒，可被三種磷酸酶催化變?yōu)榧〈?，因此是一種短時(shí)效信使物質(zhì)。DG脂溶性強(qiáng)，可活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)發(fā)揮作用。PKC多肽鏈上有親水的催化活性中心和疏水的膜結(jié)合區(qū)兩個(gè)功能域。PKC主要分布于胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞接收到刺激信號(hào)使PIP2分解生成IP3和DG，導(dǎo)致質(zhì)膜中DG含量瞬間積累。PKC與DG結(jié)合在質(zhì)膜內(nèi)表面，并在Ca2+和磷脂酰絲氨酸共同作用下使PKC激活，DG的結(jié)合還可使PKC對(duì)Ca2+的親和力大幅提高。這就使得在生理濃度Ca2+水平PKC即可被激活，激活的PKC進(jìn)一步修飾某些蛋白質(zhì)或酶的磷酸化反應(yīng)，表現(xiàn)其信息效應(yīng)。

3.G蛋白調(diào)節(jié)離子通道：Gαs亞基被證明至少可抑制心肌Na離子通道和調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞中的Ca離子通道這兩種通道，而Gαi也能抑制Ca離子通道而激活K離子通道。在活化心肌上K離子通道能力方面Gβγ比Gαi更高效。此外，所有G蛋白均能長(zhǎng)期調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和基因表達(dá)，由異源三聚體G蛋白途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化[5]。

四、G蛋白耦聯(lián)受體的分類及其在人食管下括約肌上的表達(dá)

G蛋白耦聯(lián)受體的分類：以G蛋白耦聯(lián)受體一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性為分類標(biāo)準(zhǔn)可將其分為A、B、C三系[9]。

1.A族(視紫紅質(zhì)/β腎上腺素受體樣受體族)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)：ECL1與ECL2間有二硫鍵；N末端氨基酸殘基數(shù)少；TM3胞質(zhì)面具有保守的DRY基礎(chǔ)序列(Asp-Arg-Tyr)；棕櫚?；疌ys位于C末端，形成ICL4；ICL3較長(zhǎng)；在7跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)高度保守的氨基酸序列。A族受體以種系發(fā)生為判定標(biāo)準(zhǔn)可再分為6個(gè)亞族：①速激肽、神經(jīng)肽Y、膽囊收縮肽、內(nèi)皮素等；②生物胺受體；③大麻類、腺嘌呤、嗅覺及黑皮素受體；④緩激肽和非脊椎動(dòng)物的視蛋白受體；⑤互補(bǔ)因子、促性腺激素釋放激素、趨化因子等；⑥褪黑激素受體及其他類型受體。

2.B族(胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族)包含有4個(gè)亞族：①促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子和降鈣素受體；②類胰高血糖素肽、胰高血糖素、血管活性腸肽、分泌素和垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽受體；③甲狀旁腺激素受體；④Latrotoxin受體。

3.C族包含有主要鈣受體、味覺受體、鼻神經(jīng)外激素受體、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸受體這5個(gè)亞族。上述各種類型受體廣泛分布于體內(nèi)并參與信號(hào)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等重要的生理功能，同時(shí)與帕金森癥、癲癇等疾病的病理發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)[10]。

三、調(diào)節(jié)人LES的主要激素配體及其G蛋白耦聯(lián)受體表達(dá)

人LES的體液調(diào)節(jié)主要通過激素類配體與受體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)信息傳遞和生理功能調(diào)節(jié)。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，體液中存在的激素類物質(zhì)可影響人LES的靜息張力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人LES上存在多種G蛋白耦聯(lián)受體表達(dá)。因此推斷，通過開發(fā)與人LES上G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合的藥物可能實(shí)現(xiàn)治療食管動(dòng)力性疾病的目的。

1.速激肽及NK類受體：張珂等發(fā)現(xiàn)在人LES、胃小彎和食管下段環(huán)形肌上NK受體均有表達(dá)。NK1、NK2和NK3受體分別由TACR1、TACR2和TACR3基因編碼，其受體蛋白表達(dá)量NK2>NK1>NK3[10]。速激肽類物質(zhì)包含有神經(jīng)激肽B(neurokinin B，NKB)、P物質(zhì)(substance P)和神經(jīng)激肽A(neurokinin A，NKA)，通過與NK類受體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)LES肌張力作用。有作者研究表明，靜脈注射P物質(zhì)使其在血液濃度一過性增高時(shí)，隨著濃度增加，人LES肌張力隨之增大。通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毒蕈堿受體在此過程發(fā)揮主要作用，而靜注NKA也有同樣效果，但其作用機(jī)制并不依賴于膽堿能信號(hào)傳輸系統(tǒng)。另外，多篇文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，人LES的體液調(diào)節(jié)速激肽類物質(zhì)為主要調(diào)節(jié)因子[11-12]。

2.蛙皮素(bombesin，BBS)：最初研究認(rèn)為其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，后期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)各種胃腸激素釋放其具有調(diào)節(jié)LES舒縮作用，并且這種對(duì)LES的調(diào)節(jié)不會(huì)被酚妥拉明、阿托品所阻斷[14]。BBS相關(guān)肽和雨蛙素對(duì)正常人LES平均壓力有下調(diào)作用，而對(duì)賁門失馳緩癥患者的LES平均壓力具有升高作用[14]。但其在所有體液調(diào)節(jié)中所占比重大小目前尚不清楚。

3.膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、胃動(dòng)素和胃泌素也可使人LES收縮。研究還發(fā)現(xiàn)CCK靜注犬類體內(nèi)對(duì)LES張力無(wú)影響，但在犬胃膨脹前靜注CCK拮抗劑會(huì)降低LES松弛[15]。胃動(dòng)素作為有22個(gè)氨基酸的胃腸多肽激素除了可以使人LES收縮外，還能夠使胃腸道動(dòng)力提高。其作用是通過與LES平滑肌上的胃動(dòng)素受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，這一結(jié)合可被阿托品和六甲季銨所拮抗[16-17]。高立平等[18]和Perdikis等[16]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胃泌素可使LES肌張力升高。但Nelson等[19]發(fā)現(xiàn)胃泌素可能與胃食管反流病患兒的LES壓力下降之間存在重要關(guān)聯(lián)。胃泌素對(duì)LES的作用尚須更深入的研究。5-羥色胺、前列腺素、生長(zhǎng)抑素β腎上腺素、溶血磷脂酸和促胰液素這幾類胃腸道激素類物質(zhì)受體在人LES上葉均有不同程度表達(dá)，但研究發(fā)現(xiàn)這些胃腸激素物質(zhì)對(duì)LES的舒縮調(diào)節(jié)作用均較小[20-23]。

隨著研究的不斷進(jìn)展，未來(lái)食管胃結(jié)合部的功能也會(huì)進(jìn)一步明確。隨著神經(jīng)、自身和體液激素對(duì)LES的調(diào)節(jié)作用不斷被發(fā)現(xiàn)，未來(lái)食管動(dòng)力性疾病的藥物治療方法可能會(huì)取代外科手術(shù)。