酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)方保存液對(duì)大鼠肝臟低溫保存的作用*

許 華， 蘇本金， 江海香， 黃亞?wèn)|

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院，2醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東廣州510632)

原發(fā)性移植物無(wú)功能(delayed graft function，DGF)一直是器官移植界多年來(lái)未能解決的問(wèn)題。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)器官在體外低溫保存期間失去了正常存在于血漿中的營(yíng)養(yǎng)因子(trophic factors，TFs)對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和支持作用，這可能與DGF的發(fā)生有關(guān)［1］。此后，新型營(yíng)養(yǎng)因子保存液逐漸成為器官保存液研制的一個(gè)熱門方向［2－3］。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)作為營(yíng)養(yǎng)因子的重要成員，具有創(chuàng)傷修復(fù)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和內(nèi)臟保護(hù)等活性，對(duì)缺血再灌注臟器起到很好的保護(hù)效果［4－5］。本研究采用低溫保存模型，以臨床常用的高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤(hypertonic citrate adenine，HCA)溶液作為對(duì)照，研究aFGF對(duì)供肝的保存效果。

材料和方法

1 藥品與溶液的配制

重組人 aFGF14－154，濃度為 0．126 g/L，比活性 8．3 × 108U/L，由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心研制。HCA液，配方為 K+80 mmol/L，Na+80 mmol/L，MgSO441 mmol/L，枸櫞酸55 mmol/L，腺嘌呤 0．38 mmol/L，甘露醇 30 g/L，pH 值7．0 ± 0．1，滲透壓為380 mOsm/L。aFGF復(fù)方保存液，即在HCA保存液中加入aFGF14－15440μg/L?？捡R斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue，CBB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

2 動(dòng)物與分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體重180～200 g，清潔級(jí)動(dòng)物，購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為單純HCA保存液組(對(duì)照組)和aFGF復(fù)方保存液組(實(shí)驗(yàn)組)，每組12只;根據(jù)離體肝臟保存的不同時(shí)間，再分為2個(gè)亞組，每組6只。

3 大鼠離體肝臟單純低溫保存模型的制備

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。手術(shù)，游離左腎靜脈水平以下的腹主動(dòng)脈結(jié)扎阻斷，在腎臟動(dòng)脈下方1．5 cm處的腹主動(dòng)脈插入留置針并固定，利用三通注射含100 U肝素生理鹽水1 mL，完畢后開始灌注單純HCA液或aFGF復(fù)方保存液。灌注液置于低溫4℃條件下保存，按12 mL/min流速灌注。開始灌注的同時(shí)手術(shù)線阻斷腹腔動(dòng)脈以上的腹主動(dòng)脈，并迅速剪開肝上、下的下腔靜脈，讓灌洗液順利流出，約5 min，使肝臟呈現(xiàn)質(zhì)地均勻土黃色。切取供肝吸干稱重后置于4℃等體積的保存液中。

4 觀察指標(biāo)

4．1 肝臟保存前后重量差 計(jì)算公式為:肝臟重量差(g)=保存后肝重量(g)－保存前肝重量(g)。

4．2 生化指標(biāo) 供肝保存12和24 h后，分別取肝臟保存液2 mL于－80℃冰箱中，待測(cè)ALT和AST含量;分別取肝中葉組織1 g置于－80℃冰箱，待實(shí)驗(yàn)完成后同批測(cè)定MDA含量。

4．3 組織病理學(xué)變化 取肝中葉組織約1．0 cm ×0．5 cm×0．5 cm投入20倍于肝體積的4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較使用t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同時(shí)間保存后肝臟重量的變化

肝臟的重量隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而增加。在12 h保存時(shí)點(diǎn)，2組肝臟的重量差無(wú)顯著差異(P＞0．05)，而在24 h保存時(shí)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組肝臟重量差為(0．79±0．20)g，明顯低于對(duì)照組肝臟重量差［(1．10±0．40)g］，2組間比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1．Changes of liver weight difference after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．ˉx±s．n=6．*P＜0．05 vs HCA group．圖1 各組大鼠肝臟重量的變化

2 不同保存時(shí)間后保存液中ALT和AST活性的變化

保存液中ALT和AST變化見表1。在12 h時(shí)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組ALT活性明顯低于對(duì)照組，2組間比較差異顯著(P＜0．05);在24 h時(shí)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組ALT和AST活性與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0．05)，且實(shí)驗(yàn)組 ALT明顯低于對(duì)照組(P ＜0．01)。這表明實(shí)驗(yàn)組的肝損害程度明顯低于對(duì)照組，即aFGF對(duì)所保存供肝具有一定的保護(hù)作用。

表1 各組大鼠肝臟ALT和AST活性的比較Table 1．The activity of ALT and AST after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA solution or aFGF compound solution(103 U/g．ˉx±s．n=6)

3 保存后不同時(shí)點(diǎn)肝臟組織中MDA含量的變化

肝臟在2種保存液中4℃保存12 h后，其MDA含量無(wú)顯著差異(P＞0．05)，而在24 h保存時(shí)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組MDA含量明顯低于對(duì)照組 (P＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Content of MDA after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound solution．ˉx±s．n=6．*P ＜0．05 vs HCA group．圖2 各組大鼠肝臟MDA含量的變化

4 不同時(shí)點(diǎn)保存后肝臟組織病理學(xué)改變

肝臟保存12 h后，HCA組肝小葉中央靜脈周圍有肝細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮、胞漿深染等變化，見圖3A;而實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞連接相對(duì)緊密，肝索排列有序，見圖3B。24 h時(shí)對(duì)照組肝組織水腫嚴(yán)重，細(xì)胞破碎排列松散，嗜酸性增強(qiáng)，核深染固縮，見圖3C;而實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞仍能維持較完整的形態(tài)，見圖3D。

Figure 3．Morphological changes of liver after hypothermic preservation for 12 and 24 h in HCA or aFGF compound group(HE staining，×400)．A:12 h in HCA group;B:12 h in aFGF compound group;C:24 h in HCA group;D:24 h in aFGF compound group．圖3 各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果

討 論

已有的實(shí)驗(yàn)表明，生物營(yíng)養(yǎng)因子具有顯著減輕多種離體臟器冷缺血的損傷。McAnulty等［2］首次在UW保存液中補(bǔ)充了多種生物營(yíng)養(yǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin － like growth factor，IGF－1)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)等對(duì)狗進(jìn)行腎臟移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，營(yíng)養(yǎng)因子添加組顯著改善了低溫腎臟保存的質(zhì)量和持久性，能實(shí)質(zhì)性地防止冷缺血損傷。隨后，在其它的器官移植的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)因子同樣對(duì)肝臟、心臟保存起到很好的保存作用［6－7］。aFGF作為生物營(yíng)養(yǎng)因子重要成員之一，與其它生物營(yíng)養(yǎng)因子NGF、EGF、IGF相比，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)、再生并參與神經(jīng)再生等廣泛的生物活性。但尚未見將aFGF用于器官保存液的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)觀察HCA保存液和aFGF復(fù)方保存液對(duì)大鼠肝臟的保存作用，探討了aFGF對(duì)肝臟低溫保存效果的影響。結(jié)果表明，HCA對(duì)照組在肝臟保存12 h具有良好的肝臟保護(hù)效果，但24 h時(shí)肝臟發(fā)生較明顯的水腫，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間低溫冷凍保存抑制了細(xì)胞膜上離子泵的活性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增高，引起離子紊亂，以致HCA液易發(fā)生細(xì)胞的水腫［8］。多器官保存液HCA中加入aFGF，可明顯改善原HCA液對(duì)肝臟的冷藏保存效果。aFGF復(fù)方保存液組肝重量差減小，表明aFGF可拮抗隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)的肝臟水腫的不斷增加，這可能是aFGF參與了細(xì)胞張力調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞鈣離子濃度平衡，抑制細(xì)胞發(fā)生腫脹，保護(hù)了細(xì)胞膜［9］。

氧自由基在缺血缺氧時(shí)可加強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜，以及線粒體功能障礙，造成細(xì)胞損傷和死亡［10］。aFGF復(fù)方保存液組MDA含量較HCA組顯著降低，表明aFGF具有一定的抗氧化損傷作用，可能是aFGF的非促分裂活性，即神經(jīng)和血管保護(hù)作用、激素樣特性等，保護(hù)細(xì)胞膜免受冷保存時(shí)細(xì)胞自由基水平升高所致的損傷［11－13］。aFGF復(fù)方保存液組肝灌洗液中ALT和AST活性比對(duì)照組下降更為顯著，進(jìn)一步驗(yàn)證了aFGF對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，具有降低組織損傷或壞死的作用［14］。以上結(jié)果表明，aFGF復(fù)方保存液具有減輕肝損傷的作用，其機(jī)制可能是:(1)抑制細(xì)胞腫脹;(2)拮抗氧自由基的損傷，從而減輕肝損傷。因此，aFGF彌補(bǔ)了HCA液易發(fā)生細(xì)胞的水腫和對(duì)無(wú)氧自由基清除能力不足的缺陷，兩者產(chǎn)生了互補(bǔ)和(或)協(xié)同作用。

綜上所述，在HCA保存液中加入aFGF，在一定程度上減輕了大鼠肝臟灌注及冷保存所致肝細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與aFGF抑制肝細(xì)胞腫脹及拮抗自由基損傷雙重作用有關(guān)。能否將aFGF等一系列的營(yíng)養(yǎng)因子作為臨床器官保存液的常規(guī)添加劑、加入多大濃度的aFGF更合適、常用器官保存液配方對(duì)aFGF作用的影響等問(wèn)題，值得進(jìn)一步研究。

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