弓形蟲快速鑒定及國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物感染調(diào)查

高正琴

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，T.gondii）在分類上屬頂復(fù)亞門（Apicomplexa）孢子蟲綱（Sporozoasida）真球蟲目（Eucoccidiorida）弓形蟲科（Toxoplasmatidae），是一種單細(xì)胞寄生蟲。1908年，首先由法國學(xué)者Nicolle和Manceaux從一種叫做剛地梳趾鼠（Ctenodactylus gondii）的沙漠嚙齒類動物的肝、脾單核細(xì)胞中分離出來，該動物被用作動物模型，在突尼斯巴斯德研究所查爾斯尼科爾的實(shí)驗(yàn)室里研究利什曼[1]。與此同時，Splendore在巴西的一只兔體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了弓形蟲[2]。隨后，世界各地相繼在多種脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了弓形蟲。弓形蟲有三個主要的生命周期階段：1）速殖子（tachyzoite）（希臘語tachos=speed；快速繁殖的階段）；2）緩殖子（bradyzoite）（希臘語 brady=slow；在組織中發(fā)現(xiàn)的可傳播的階段）；3）在貓的腸道中發(fā)現(xiàn)的有性階段[3]。在實(shí)驗(yàn)室中，速殖子可以被無限期地維持和培養(yǎng)[4]。弓形蟲的終宿主只有貓科動物，但其中間宿主十分廣泛，包括人類、家畜、鳥類、海洋哺乳動物、蛇等[5]。人和動物感染率極高，引起弓形蟲病（toxoplasmosis），呈世界性分布。據(jù)報道全球超過三分之一的人感染弓形蟲[6]。

對于弓形蟲病，至今尚無有效的防控手段。因此，開發(fā)新的診斷工具，特別是快檢技術(shù)用于監(jiān)測疫病的暴發(fā)流行就顯得非常重要。目前，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物的弓形蟲感染概況在很大程度上是未知的。目前尚未見不同方法檢測鑒定實(shí)驗(yàn)動物弓形蟲的具體研究和感染調(diào)查的報道。本研究首次采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymeras chain reaction，PCR）和直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)（direct microscopy real-time dynamic video recording technique），對國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物的弓形蟲進(jìn)行快速檢定和感染調(diào)查，為國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2012年12月至2016年12月，12 394只表觀健康的實(shí)驗(yàn)動物（包括：猴290只、小型豬425只、犬579只、兔1 234只、地鼠372只、豚鼠1 363只、大鼠987只、小鼠7 144只）來自全國60個不同廠家。采血分離血清。

1.2 主要試劑

弓形蟲抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）和弓形蟲循環(huán)抗原 CAg檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司；DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）購自德國 Qiagen公司；dNTPMixture、EX Taq、Agarose、DNA Marker購自日本 TaKaRa公司；Nuclease-Free Water購自美國Progema公司。

1.3 主要儀器

THERMO MULTISKAN MK3全自動酶標(biāo)儀（Thermo ELECTRON CORPORATION，美國）；Verity 96 Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystyem，美國）；Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)（東樂自然基因生命科學(xué)公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國）；LEICA DM2500 生物顯微鏡（Leica M icrosystems，德國）；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon，日本）。

1.4 ELISA檢測弓形蟲抗體IgG和循環(huán)抗原CAg

用ELISA方法檢測血清樣本中弓形蟲抗體IgG和循環(huán)抗原CAg。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對照、臨界對照和陽性對照。酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度 A?？贵w IgG結(jié)果判定：樣本A450值＜臨界對照平均值為陰性，樣本A450值≥臨界對照平均值為陽性。循環(huán)抗原CAg結(jié)果判定：樣本 A450值＜臨界對照平均值 ×0.90為陰性，樣本A450值＞臨界對照平均值×1.10為陽性。根據(jù)試劑盒說明書上判定結(jié)果：弓形蟲抗體IgG和循環(huán)抗原CAg任意一個陽性即定義為弓形蟲感染陽性，否則為陰性。計算弓形蟲總感染率（弓形蟲感染陽性數(shù)/總數(shù)×100%）。

1.5 引物設(shè)計和DNA提取

根據(jù)GenBank中公布的弓形蟲p30基因序列（major surface parasite antigen）（GenBank登錄號：S76248），設(shè)計一對 PCR引物（表1）。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。用QIAamp DNA Mini Kit提取待測血清樣本 DNA，具體操作見試劑盒說明書。

1.6 PCR擴(kuò)增和電泳檢測弓形蟲

PCR總反應(yīng)體積為50μL，包括：5.0μL 10×Buffer（Mg2+Plus），4.0 μL dNTP Mixture，正、反向引物各 0.5 μL，0.25 μL EX Taq（5 unit/μL），3.0 μL模板 DNA，37.25 μL Nuclease-Free Water。 PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 1 m in，1個循環(huán)；95℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，1 cycle。試驗(yàn)中陽性對照為弓形蟲1型RH株，陰性對照為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）、四翼無刺線蟲（Aspiculuris tetraptera）、隱匿管狀線蟲（Syphacia obvelata）、鼠管狀線蟲（Syphacia muris）。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠成像分析系統(tǒng)攝錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測弓形蟲

在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，待測血清用生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后滴片，采用直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視頻攝錄技術(shù)檢測樣本中寄生蟲病原體。根據(jù)蟲體的形態(tài)和大小來進(jìn)行蟲種的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測弓形蟲抗體IgG和循環(huán)抗原CAg結(jié)果

用ELISA法對12 394只動物進(jìn)行了弓形蟲檢測，每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對照、臨界對照、陽性對照，符合條件者試驗(yàn)結(jié)果方有效。結(jié)果：循環(huán)抗原CAg檢出陽性率為0（0/12 394），抗體 IgG檢出陽性率為0.03%（4/12 394）。初次檢測結(jié)果顯示，在12 394份血清中檢出4份血清弓形蟲抗體IgG陽性，第一次檢測 A值分別為 2.074、1.954、1.494、1.167；陰性對照值為 0.054；臨界值為 0.520、0.519、0.527；陽性對照值為2.596。用同樣方法對這4份血清再次檢測，第二次檢測 A值分別為 1.272、1.075、0.810、0.649；陰性對照值為 0.053；臨界值為0.519、0.526、0.516；陽性對照值為 2.453。 這 4 份血清第三次檢測 A值分別為1.228、1.460、1.109、1.278；陰性對照值為 0.053；臨界值為 0.448、0.445、0.412；陽性對照值為 2.350。根據(jù)上述結(jié)果，判定這4份血清樣本弓形蟲抗體IgG陽性。這4份陽性樣本均來自于豚鼠（表2）。應(yīng)用ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)動物弓形蟲，結(jié)果從12 394份實(shí)驗(yàn)動物樣本檢出了4份弓形蟲陽性樣本，弓形蟲總感染率為0.03%（4/12 394）。

2.2 PCR檢測弓形蟲結(jié)果

以抽提的樣本 DNA為模板，用優(yōu)化后的 PCR方法檢測待測血清樣本中的弓形蟲 DNA。12 394份實(shí)驗(yàn)動物血清樣本弓形蟲核酸PCR檢出陽性樣本4份，陽性率0.03%，與弓形蟲抗體 IgG檢測陽性樣本（0.03%）一致。結(jié)果如圖1顯示，這4份弓形蟲抗體IgG陽性豚鼠血清中均出現(xiàn)了特異性的目的基因條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的弓形蟲p30基因1 634 bp大小相一致。PCR檢測結(jié)果說明，這4份弓形蟲抗體IgG陽性豚鼠血清中確實(shí)存在弓形蟲DNA（圖 1）。

2.3 直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測弓形蟲結(jié)果

直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測，在血清樣本中發(fā)現(xiàn)蟲體呈弓形如月牙狀，長5～7μm，寬2～4μm，一端較尖，另一端鈍圓；一側(cè)扁平，另一側(cè)較膨?。▓D2）。依據(jù)蟲體的大小和形態(tài)特征，鑒定為弓形蟲速殖子。直接鏡檢實(shí)時動態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測12 394份實(shí)驗(yàn)動物血清樣本檢出弓形蟲蟲體陽性樣本4份，陽性率0.03%，與弓形蟲IgG抗體和p30基因檢測結(jié)果相吻合（表2）。然而，此類形態(tài)學(xué)鑒定不足之處為定性檢查而非定量檢測，該滴片法更不適于蟲體計數(shù)。因此，對于臨床癥狀不典型的感染動物，應(yīng)采集血液、精液、腹腔液及靶器官組織，用實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行弓形蟲感染的動態(tài)分布檢測，這在后繼感染性試驗(yàn)中精確定量檢測弓形蟲病原體十分必要。

圖1 PCR擴(kuò)增感染動物血清樣本弓形蟲p30基因特異性DNA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products am p lified by p rim ers targeted p30 gene specific DNA of genom ic DNA extracted from serum sam p les of anim als in fected w ith Toxop lasm a gondii

圖2 中國實(shí)驗(yàn)動物中弓形蟲速殖子鏡檢形態(tài)Fig.2 M icroscop ic m orphology of Toxoplasma gondii tachyzoite derived from laboratory anim als in China

表2 中國實(shí)驗(yàn)動物中弓形蟲感染情況Tab le 2 The p revalence of Toxoplasm a gondii in laboratory anim als in China

3 討論

目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為全世界的剛地弓形蟲只有一個種，一個血清型。弓形蟲寄生在幾乎所有有核細(xì)胞中，不僅可經(jīng)胎盤垂直傳播，而且是一種重要的機(jī)會致病原蟲（opportunistic protozoan）。孕婦感染弓形蟲可致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒畸形或產(chǎn)出弱智兒，先天性弓形蟲病新生兒的典型表現(xiàn)有腦積水、小腦畸形、大腦鈣化、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎及精神、運(yùn)動障礙，還可伴有發(fā)熱、皮疹、嘔吐、腹瀉、黃疸、肝脾腫大、貧血、心肌炎、癲癇等。1979年在美國、1997年在加拿大和2006年在巴西分別暴發(fā)了急性弓形蟲病。弓形蟲感染可引起多臟器損害。弓形蟲急性播散，?？梢鹉X膜腦炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、肝炎、肺炎、心肌心包炎、廣泛性肌炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎和腹膜炎等。在艾滋病患者中報告的弓形蟲腦炎的頻率增加，尤其是那些有顯著免疫抑制的患者在CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)＜200細(xì)胞/m L時，而弓形蟲感染被認(rèn)為是導(dǎo)致艾滋病患者死亡的一種重要的機(jī)會性病原[7-8]。在抗腫瘤治療過程中，癌癥還可以重新激活潛伏的弓形蟲感染[9]。包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤可以重新激活弓形蟲病[10]。從血清陽性供體移植器官可以在接受免疫治療血清陰性受體中激活潛伏性感染。從血清陰性供體移植器官也能通過激活免疫抑制治療的血清陽性受體的潛伏性感染來啟動致命的感染。將受感染的器官移植到血清陰性受體的危險似乎大于將未受感染的器官移植到血清陽性受體的危險[11]。據(jù)報道，在心臟、肝臟、骨髓、造血干細(xì)胞移植受體者中出現(xiàn)了致命的弓形蟲病[12-15]。家畜感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕、死胎，不僅對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，還威脅著人類健康。研究表明慢性弓形體病與一些自身免疫性疾病、精神和神經(jīng)退行性疾病有很大關(guān)系。弓形蟲感染可以操縱和改變行為。由此可見，弓形蟲病具有重要的社會公共衛(wèi)生意義。

弓形蟲感染的檢測可采用病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等方法。顯微鏡檢查弓形蟲病原體特異性強(qiáng)但敏感性低，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別，工作量大操作繁瑣且具有一定的生物安全性危害。血清學(xué)方法比較簡便快捷便于批量檢測，然而，抗核抗體、類風(fēng)濕因子和同型自然抗體（natural antibody）等，可使血清學(xué)方法測定弓形蟲抗體時呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)；對于免疫抑制個體或潛伏感染未激發(fā)產(chǎn)生抗體的個體則會呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，對于弓形蟲病的診斷需要結(jié)合多種方法的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。近年來，將PCR和核酸探針技術(shù)應(yīng)用于弓形蟲感染的檢測，更具有靈敏、特異、早期診斷的意義，并開始試用于臨床[16-17]。Burg等[18]和Homan等[19]報道用PCR方法分別檢測弓形蟲基因組中35-拷貝B1基因首尾串聯(lián)（head-to-tail tandem）（GenBank accession number AF179871）194 bp 和300-拷貝 529 bp重復(fù)元素序列（repeat element sequence， RE） （GenBank accession number AF146527）。Cassaing等[20]報道用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，檢測弓形蟲B1、RE基因，比較了胎兒、新生兒、免疫低下和眼弓形蟲病患者的診斷，結(jié)果顯示，弓形蟲病B1基因分子診斷僅有33.3%的陽性率，而用RE基因?qū)ρ蛩?、房水、全血、腦脊液和支氣管肺泡液等樣品有更高的陽性率。Wang等[21]報道用 MAT（modified agglutination test，改良的凝集試驗(yàn)）檢出中國河南地區(qū)肉兔血清弓形蟲抗體陽性率為3.6%（44/1 213）。Pastorello等[22]報道 HIV病人死亡是由嚴(yán)重播散性弓形體病引起的彌散性壞死性肺炎、腦炎和難治性膿毒性休克的結(jié)果。Edvinsson等[23]報道在DNA濃度較低時，應(yīng)用弓形蟲529 bp重復(fù)元素實(shí)時PCR提高了臨床免疫缺陷移植受體血液中弓形蟲感染診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。Bourdin等[24]報道PCR檢測免疫缺陷患者血液樣本中弓形蟲的敏感性高于免疫能力較強(qiáng)的患者。Burrells等[25]報道分別用ELISA和qPCR對人工感染弓形蟲的小牛和小鼠進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)舌、腦和隔膜接種的小鼠具有較高的弓形蟲DNA載量，如低Cq值所示；經(jīng)半腱肌接種的小鼠有較高的DNA載量（由低Cq值表示）和強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)；經(jīng)腰大肌接種的小鼠也顯示低Cq值，但在ELISA中呈陰性；經(jīng)肝臟、心臟和三頭肌接種的小鼠抗體為陰性，具有較高的Cq值，但仍被歸類為qPCR陽性；經(jīng)咬肌和背最長肌接種的小鼠保持了qPCR和ELISA陰性；抗體陽性小牛的咬肌、心臟、隔膜、三頭肌、半腱肌中檢出了 DNA，肝臟中未檢出DNA。因此，研究認(rèn)為：在實(shí)驗(yàn)性感染動物弓形蟲傳播的檢測中，一個單一的測試并不能說明全部的情況。

本研究首先采用ELISA法進(jìn)行弓形蟲抗體（IgG）和循環(huán)抗原（CAg）檢測，然后再采用 PCR鑒定弓形蟲p30基因進(jìn)行確診，兩者的檢測結(jié)果一致并由弓形蟲速殖子形態(tài)學(xué)識別確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物中確實(shí)存在弓形蟲感染。此次感染弓形蟲的豚鼠均為普通級動物，雖然飼養(yǎng)在相對獨(dú)立封閉的空間內(nèi)，但依舊無法排除人、野鼠、貓、犬等傳播的弓形蟲病，被污染的飼料、飲水、墊料也可能造成該病原體感染的進(jìn)一步擴(kuò)散傳播。實(shí)驗(yàn)動物感染弓形蟲后，在正常免疫力的作用下，一般不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，大多數(shù)處于隱性感染狀態(tài)，但在免疫功能下降、處于應(yīng)激狀態(tài)或合并感染其他病原微生物時就可能導(dǎo)致嚴(yán)重感染甚至死亡。盡管國內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理部門已采取了一些相對嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)管措施，然而一些廠家自身管理仍存在一定問題。因此，切實(shí)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)管工作，配備精干高效的抽檢隊(duì)伍，制定嚴(yán)格合理的篩查監(jiān)測程序，選用快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)，做好弓形蟲病的預(yù)防傳播工作就顯得尤為重要。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步加大樣本采集數(shù)量，擴(kuò)大樣本采集范圍，為全面掌握我國實(shí)驗(yàn)動物弓形蟲感染情況和綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。