糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型大鼠在性別上的差異性研究*

鐘志勇 梁志健 劉月姝 李思婷 梁冠澤 謝超敏 唐小江

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248）

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少、骨纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性病變?yōu)橹饕卣?，可?dǎo)致患者骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的全身性骨骼系統(tǒng)疾病。目前骨質(zhì)疏松患者已超過2億，居世界常見疾病的第七位[1]。研發(fā)治療骨質(zhì)疏松新型、高效、價(jià)格低廉的藥物首先是建立可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）模型多用于模擬臨床上因使用糖皮質(zhì)激素所導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。對于GIOP模型，其發(fā)生的機(jī)理、常用的藥物及其劑量等已有報(bào)道[2-5]，但動(dòng)物性別對GIOP模型的影響卻鮮有研究。故本研究采用兩種性別的SD大鼠分別給予地塞米松以制備GIOP模型，比較不同性別的GIOP大鼠模型的區(qū)別，完善GIOP模型的背景數(shù)據(jù)，為模型的應(yīng)用提供資料參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（廣東三才石岐制藥有限公司，批號 20140763）；Rat 1，25-dihydroxyvitamin D3 ELISA Kit（武漢華美生物工程有限公司，批號：C1001070151）；Rat Calcitonin ELISA Kit（武漢華美生物工程有限公司，批號：T02011771）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

7020型全自動(dòng)生化分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific；Unigamma M骨密度儀，意大利 l'acn；QX-W400型電子萬能試驗(yàn)機(jī)，上海企想檢測儀器有限公司；RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國 LEICA?；TS-12C型生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；EG1150型生物組織包埋機(jī)，德國LEICA?；CS-Ⅵ型攤片烤片機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；BX43型生物顯微鏡，日本 OLYMPUS?；CellSens Standard顯微圖像軟件，日本OLYMPUS?。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠24只，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證明編號：44007200023787、44007200023788。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：6只/箱，群養(yǎng)，溫度與濕度分別為 20～26℃、40%～70%，采用10 h：14 h晝夜間斷照明，自由進(jìn)食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)證明編號：00117781、00117782。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)至3月齡后，隨機(jī)分為正常對照組和骨質(zhì)疏松組，12只/組，雌雄各半。骨質(zhì)疏松組雌性大鼠和雄性大鼠在第1天～第21天按2.5 mg/kg體質(zhì)量，第22天 ～第63天按1 mg/kg體質(zhì)量肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液，1次/2 d，持續(xù)9周。末次注射后1 h，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（劑量為45 mg/kg），腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-80℃保存。取雙側(cè)股骨和腰椎 L4，進(jìn)行骨密度和生物力學(xué)檢查；取脛骨，10%中性甲醛固定，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.5 指標(biāo)的檢測

1.5.1 骨密度測定：取上述右側(cè)股骨和腰椎L4置于Unigamma M骨密度儀，應(yīng)用軟件中的小動(dòng)物對進(jìn)行掃描，測定骨密度值（bone mineral density，BMD）。

1.5.2 骨生物力學(xué)測定：采用三點(diǎn)彎曲法，取上述凍存的左側(cè)股骨，室溫下復(fù)溫，置于QX-W400型電子萬能試驗(yàn)機(jī)，跨距為20.00 mm，加載速度為2.00 mm/min，下壓于股骨中段，至股骨斷裂。記錄彈性載荷、最大載荷、彈性橈度，并用游標(biāo)卡尺測量股骨斷面的最大內(nèi)、外徑和最小內(nèi)、外徑。根據(jù)公式計(jì)算股骨的彎曲彈性模量、最大彎曲應(yīng)力、最大應(yīng)變、骨剛性系數(shù)。

截面慣性矩：J=π（BH3-bh3）/64；最大彎曲應(yīng)力：σb=FmaxLH/8 J；最大應(yīng)變 εb=12dmaxH/2L2：骨剛性系數(shù)：EJ=FpL3/48dp。（B為股骨測量橫斷面的最大外徑，H為股骨測量橫斷面的最小外徑，b為股骨測量橫斷面的最大內(nèi)徑，h為股骨測量橫斷面的最小內(nèi)徑、Fp為彈性載荷，L為跨距，J為截面慣性矩，dp為彈性橈度、Fmax為最大載荷，dmax為最大撓度）

1.5.3 血清生化指標(biāo)測定：取上述血清，按照ELISA試劑盒說明書，測定其中維生素 D3、降鈣素的含量；運(yùn)用全自動(dòng)生化儀測定其中 ALP、Ca、P的含量。

1.5.4 脛骨的病理檢測：取上述浸泡于10%中性甲醛固定液中的脛骨，經(jīng)脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色等操作，然后觀察骨皮質(zhì)是否變薄，骨小梁是否減少、疏松、變細(xì)、斷裂，成骨細(xì)胞是否減少、破骨細(xì)胞是否增多，并逐項(xiàng)進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為：“0”分表示H.E染色結(jié)果基本正常；“1”分表示H.E染色結(jié)果偶見輕微病變；“2”分表示H.E染色結(jié)果輕度病變，范圍≦1/4視野；“3”分表示H.E染色結(jié)果中度病變，范圍≦1/2視野；“4”分表示H.E染色結(jié)果重度病變，病變范圍≧3/4視野；如觀察結(jié)果在“0～1”之間，則可記為“0.5”分，依次類推。計(jì)算每只動(dòng)物脛骨各項(xiàng)病理變化的總積分。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量結(jié)果

與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物體質(zhì)量在第7天 ～第 63天降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 動(dòng)物體質(zhì)量變化Fig.1 Anim al weight from d0 to d63

2.2 血清 ALP、Ca、P檢測結(jié)果

與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物ALP上升、雄鼠的Ca、P下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 性別對G IOP大鼠ALP、Ca、P的影響（±s±s，n=6）Table 1 Effect of Sex on ALP，Ca and P of G IOP rat（ ±s ±s，n=6）

表1 性別對G IOP大鼠ALP、Ca、P的影響（±s±s，n=6）Table 1 Effect of Sex on ALP，Ca and P of G IOP rat（ ±s ±s，n=6）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note：Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05，aa P＜0.01

組別 性別 ALP/（U/L）Ca/（mmol/L）P/（mmol/L）正常對照組2.41±0.05 2.16±0.47骨質(zhì)疏松組♂ 142.2±19.3 2.44±0.04 2.42±0.50♀ 71.3±13.7 2.46±0.07 2.26±0.25♂ 170.7±23.3a 2.32±0.07aa 1.86±0.32a♀ 115.0±36.1a

2.3 血清降鈣素、維生素D3檢測結(jié)果

與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組雄鼠的降鈣素下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其余指標(biāo)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

2.4 股骨、椎骨BM D檢測結(jié)果

第21天時(shí)，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物的BMD高于正常對照組；第41天時(shí)，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物BMD開始低于正常對照組。在結(jié)束實(shí)驗(yàn)第63天時(shí)，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物的股骨BMD低于正常對照組，且骨質(zhì)疏松組的雄鼠腰椎L4 BMD亦低于正常對照組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 0.01），見表3。

表2 性別對GIOP大鼠降鈣素、維生素D3的影響（±s±s，n=6）Tab le 2 Effect of Sex on calcitonin and vitam in D3 of GIOP rat（±s±s，n=6）

表2 性別對GIOP大鼠降鈣素、維生素D3的影響（±s±s，n=6）Tab le 2 Effect of Sex on calcitonin and vitam in D3 of GIOP rat（±s±s，n=6）

組別 性別 降鈣素/（fmol/L）維生素D3/（1 ×103 fmol/L）正常對照組 ♂ 4.63±1.55 62.3±28.5♀ 4.21±2.53 57.8±26.0♂ 2.01±0.61aa 48.5±19.6♀骨質(zhì)疏松組3.58±1.73 39.5±17.6

表3 性別對G IOP大鼠股骨、腰椎L4 BM D的影響（±s ±s，n=6）Tab le 3 Effect of Sex on BM D of fem ur and L 4 of GIOP RAT（±s ±s，n=6）

表3 性別對G IOP大鼠股骨、腰椎L4 BM D的影響（±s ±s，n=6）Tab le 3 Effect of Sex on BM D of fem ur and L 4 of GIOP RAT（±s ±s，n=6）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note：Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05，aa P＜0.01

正常對照組骨質(zhì)疏松組♂ 0.602±0.053 0.860±0.133♀ 0.536±0.035 0.659±0.068♂ 0.506±0.040a 0.705±0.051aa♀ 0.444±0.023a 0.597±0.037

2.5 彎曲彈性模量、最大彎曲應(yīng)力、最大應(yīng)變和最大負(fù)荷檢測結(jié)果

與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組雄鼠最大應(yīng)變、最大負(fù)荷下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。其余指標(biāo)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 性別對G IOP大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響（±s±s）Table 4 Effect of Sex on biom echanical index of G IOP RAT（ ±s ±s）

表4 性別對G IOP大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響（±s±s）Table 4 Effect of Sex on biom echanical index of G IOP RAT（ ±s ±s）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05，aa P＜0.01Note： Compare with same gender rats of normal control group，a P＜0.05， aa P＜0.01

正常對照組130.0±34.9 0.13±0.02 9952±5503 177.3±26.5♀149.5±15.6 0.07±0.02 8655±3087 112.2±15.1♂骨質(zhì)疏松組 ♂136.6±14.3 0.07±0.01 6923±3320 98.9±9.1 108.7±19.0 0.10±0.02a 7403±4365 110.6±18.8aa♀

2.6 脛骨病理組織學(xué)檢測結(jié)果

正常對照組動(dòng)物脛骨結(jié)構(gòu)正常，骨皮質(zhì)未見變薄，骨小梁致密，骨小梁周圍可見成骨細(xì)胞、偶見破骨細(xì)胞，骨髓腔大小正常，骨骺可見大量透明軟骨及少量骨化的軟骨。骨質(zhì)疏松組的雌雄動(dòng)物均可見骨干變細(xì)、骨皮質(zhì)變薄，骨髓腔面積縮小，骨小梁周圍成骨細(xì)胞減少、破骨細(xì)胞增多，骨骺未見明顯異常。且骨質(zhì)疏松組動(dòng)物脛骨各項(xiàng)病理評分和總積分均高于正常對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，骨質(zhì)疏松組雄性動(dòng)物的骨小梁較該組雌性的減少、疏松和變細(xì)，該項(xiàng)評分和總積分也相應(yīng)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 5、圖 2。

表5 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項(xiàng)病理評分和總積分的影響（±s±s）Tab le 5 Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（ ±s ±s）

表5 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項(xiàng)病理評分和總積分的影響（±s±s）Tab le 5 Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（ ±s ±s）

正常對照組0.2±0.4 0.3±0.3 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.2♀0.2±0.4 0.1±0.2 0.3±0.4 0.0±0.0 0.3±0.3♂骨質(zhì)疏松組2.8±0.4a 2.8±0.4ab 2.8±0.4ab 3.3±0.8ab 2.8±0.4a♀2.1±0.9a 2.0±0.5a 2.1±0.7a 2.3±0.5a 2.4±0.8♂a

表5（續(xù)） 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項(xiàng)病理評分和總積分的影響（±s±s）Table 5（Con tinued） Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（±s ±s）

表5（續(xù)） 性別對G IOP大鼠脛骨組織各項(xiàng)病理評分和總積分的影響（±s±s）Table 5（Con tinued） Effect of Sex on tibia pathological score of of G IOP RAT（±s ±s）

注：與正常對照組同性別比較，a P＜0.05；骨質(zhì)疏松組雄性與雌性比較，b P＜0.05Note： Compare with the same gender rat of normal control group， a P＜0.05； compare with the female rat of osteoporosis group，b P＜0.05

正常對照組0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.5±0.4♀0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.8±0.8♂骨質(zhì)疏松組3.2±0.4a 3.2±0.4a 0.0±0.0a 21.0±2.7ab♀3.1±0.5a 3.1±0.5a 0.0±0.0 17.1±3.1♂a

3 討論

骨質(zhì)疏松可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性，其中繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由于藥物或疾病引起的，如過量地使用糖皮質(zhì)激素。目前，糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用于臨床，致使糖皮質(zhì)激素引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)病率增加。為了防治 GIOP、了解該病的發(fā)病機(jī)制，需建立可靠的GIOP動(dòng)物模型并不斷完善該模型的背景數(shù)據(jù)。

目前用于制備GIOP模型的動(dòng)物種類并沒有統(tǒng)一的規(guī)范，多見有嚙齒類小動(dòng)物（大、小鼠）和大動(dòng)物（兔、狗、豬等）。雖然大動(dòng)物具有哈弗氏系統(tǒng)，與人類的骨骼系統(tǒng)更為相似，但考慮到動(dòng)物的易得性和使用的廣泛性，故本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠作為研究對象。SD大鼠在6～8周齡達(dá)到性成熟，約在3月齡達(dá)到體成熟，此時(shí)骨骼系統(tǒng)發(fā)育完成，骨量也相對穩(wěn)定，故采取3月齡大鼠[6]。目前關(guān)于動(dòng)物的性別對GIOP模型的影響少有報(bào)道，選擇何種性別以更好地制備GIOP模型成為開展研究首要解決的問題之一，而這正是本研究的目的。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，雌、雄 SD大鼠注射大劑量地塞米松后均出現(xiàn)了GIOP的一系列癥狀。與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組的雄性大鼠出現(xiàn)了股骨、腰椎L4骨密度下降，血清中的 ALP升高，鈣、磷、降鈣素下降，股骨的最大應(yīng)變和最大負(fù)荷下降，脛骨組織病理評分升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而雌性大鼠僅出現(xiàn)股骨骨密度下降，ALP升高，脛骨組織病理評分升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在脛骨骨組織病理檢測中，骨質(zhì)疏松組雄鼠骨小梁較該組雌性的減少、疏松和變細(xì)，該項(xiàng)評分和病理總積分也顯著性地升高。故骨質(zhì)疏松組中的雄鼠GIOP癥狀較雌鼠的明顯。這可能與雌鼠中雌激素對骨代謝過程的保護(hù)作用有關(guān)。因?yàn)橐环矫娲萍に乜赏ㄟ^基因組或非基因組途徑對骨形成起促進(jìn)作用；另一方面，雌激素還可以抑制骨細(xì)胞的骨吸收作用[7-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，雌鼠去勢后體內(nèi)缺乏雌激素，在糖皮質(zhì)激素聯(lián)合誘導(dǎo)下，可縮短骨質(zhì)疏松的成模時(shí)間，且骨量丟失增大[10-11]。而雄激素在骨量丟失方面的作用尚未證實(shí)，也未見雄激素與糖皮質(zhì)激素協(xié)同作用的報(bào)道。故在制備單純的GIOP模型以研究糖皮質(zhì)激素對骨骼系統(tǒng)的影響時(shí)，應(yīng)考慮雌激素的影響。選擇雄性大鼠較雌性大鼠理想，因?yàn)檫@可避免雌激素的干擾，使GIOP模型更為明顯、穩(wěn)定。