利用TALEN技術(shù)制備HE4（WFDC2）敲除小鼠模型*

龍華洋 孫 丹 李金萍 江世文，3

（1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，北京 100069）（2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038）（3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，默索大學(xué)醫(yī)學(xué)院，紀(jì)念健康醫(yī)學(xué)中心，婦科與婦產(chǎn)科系，薩凡納，GA，美國(guó)，31404）（4.常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，常州 213164）

人附睪蛋白 4（Human epididymis protein 4，HE4）最初是在人附睪中被發(fā)現(xiàn)，并因此而得名[1]。此后HE4被證明是由人 Wfdc2（WAP four-disulfide core domain protein 2）基因編碼的一種分泌蛋白，因此HE4又名為 WFDC2[2]。另有研究報(bào)道，除了在人附睪中表達(dá)外，HE4也在其他正常組織器官中有表達(dá)，包括生殖系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，并且HE4在氣管中表達(dá)最高，其余依次唾液腺，肺等組織[3-4]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究指出，HE4在一些癌癥中高表達(dá)，包括卵巢癌[3，5-7]，肺癌[8-11]，子宮內(nèi)膜癌[12]。因此認(rèn)為HE4可以作為檢測(cè)這些癌癥的標(biāo)志物。在HE4相關(guān)癌癥的研究中，HE4與卵巢癌的研究最受研究者關(guān)注。目前，CA125的含量仍然是檢測(cè)卵巢癌的金標(biāo)準(zhǔn)[13]，Hellstrom等[5]用卵巢癌患者血清中的 HE4水平來(lái)檢測(cè)卵巢癌，其結(jié)果與CA125有相同的靈敏性，并且用HE4作為檢測(cè)指標(biāo)能提高惡性腫瘤檢測(cè)的特異性。Ghasem i[14]和Zhao等[15]指出，CA125聯(lián)合 HE4檢測(cè)可以提高卵巢癌檢測(cè)的敏感性和特異性。研究指出，HE4可能是促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞[16-17]和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[18]增殖的一個(gè)激活因子。而且，在癌細(xì)胞裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)HE4的腫瘤體積明顯大于對(duì)照組腫瘤[17]。上述研究提示，HE4高表達(dá)與腫瘤增殖有關(guān)，但是在正常組織中，HE4缺失的影響以及它正常的生理功能仍然不清楚。

基因敲除小鼠模型是研究動(dòng)物基因功能的重要工具之一，小鼠的基因組與人類基因組相似度達(dá)90%，有99%的基因與人類基因同源[19]，并且表達(dá)HE4蛋白的人Wfdc2在如小鼠等一些物種間高度保守[3]，但目前尚無(wú) WFDC2敲除小鼠模型來(lái)研究HE4的正常生理功能。

基因敲除技術(shù)的傳統(tǒng)方法是通過(guò)同源重組獲得基因敲除的ES細(xì)胞，然后通過(guò)嵌合體技術(shù)獲得基因敲除動(dòng)物[20]，近幾年來(lái)興起的基因編輯工具包括鋅指核酸酶 ZFN技術(shù)[21]，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶TALEN技術(shù)[22]，成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR以及CRISPR相關(guān)蛋白系統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)[23]。本研究采用TALEN技術(shù)敲除C57BL/6 J小鼠Wfdc2基因，首次獲得WFDC2敲除小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)純合WFDC2敲除小鼠出生后短時(shí)間內(nèi)死亡，為進(jìn)一步研究HE4的正常生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京生命科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中心提供。使用許可證號(hào)：SYXK（京）2015-002。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在 22℃，濕度 70%，自動(dòng)光周期（12 h明/12暗），自由采食和飲水。

1.2 主要試劑

Golden Gate TALEN assembly合成的質(zhì)粒（Addgene），10X T4 DNA ligase buffer（NEB），T4 DNA ligase（NEB），限制性內(nèi)切酶 Bsa I（NEB），Sac I，Esp3I（Fisher）質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、T載體試劑盒、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Life Technologies）。

1.3 TALENs位點(diǎn)設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI上小鼠 Wfdc2基因序列，利用TALEN在線設(shè)計(jì)工具（http：//tale-nt.cac.cornell.edu）設(shè)計(jì)基因敲除位點(diǎn)。TALENs敲除靶序列如下：TALEN-L靶向序列5'-GCA CCA TGC CTG CCT G-3'，TALEN-R靶向序列 5'-AGT AGG AGG CCA GCG GC-3'。中間的 spacer序列為 5'-TCG CCT CTG CTT GCT G-3'。

1.4 TALENs載體構(gòu)建

采用Golden gate法將識(shí)別靶序列的RVD模塊構(gòu)建到載體上。然后將TALEN片段通過(guò) Esp3I酶切構(gòu)建到pCAG-T7-TALEN載體上，使得TALEN表達(dá)有 CAG或者 T7啟動(dòng)子啟動(dòng)，其中 CAG啟動(dòng)TALENs在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，T7啟動(dòng) TALENs體外轉(zhuǎn)錄成mRNA。將測(cè)序正確的TALENs表達(dá)載體采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒備用。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄

Sac I酶切 TALENs無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，電泳回收片段，并進(jìn)行純化。以純化片段為模板，采用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成多聚腺苷酸化的mRNA。將體外轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定mRNA用NucAway Spin Columns純化回收并用顯微注射緩沖液稀釋到100ng/μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TALENs顯微注射及活性驗(yàn)證

將WFDC2的TALEN-L和 TALEN-R mRNA混合在一起后在顯微鏡（Nikon）下利用顯微操作系統(tǒng)（Eppendorf）注射到15枚 C57BL/6 J的受精卵中，培養(yǎng)3.5 d后挑選出存活的囊胚，混合一起用裂解液裂解，以裂解液為模板，以上游引物：5'-TGTGCTTCCTACCCGCCTCCT-3'和下游引物：5'-CCCGCTCCTCTTCATCAGGTCTC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用T7E1進(jìn)行酶切鑒定，其中擴(kuò)增片段大小為413 bp，酶切片段為120 bp+293 bp。驗(yàn)證 TALENs有切割活性后，按照上述方法，獲得顯微注射受精卵，將其移植到ICR代孕雌鼠輸卵管內(nèi)。

1.7 突變檢測(cè)及基因型分析

取1周齡小鼠腳趾提取基因組DNA，同時(shí)進(jìn)行編號(hào)，按照酶切鑒定方法對(duì)F0代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，并將T7E1酶切鑒定為陽(yáng)性的小鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上，進(jìn)行測(cè)序和突變基因分析。將Wfdc2基因發(fā)生移碼突變的F0代小鼠單獨(dú)建系，最后得到Wfdc2純合雙敲除小鼠。1

.8 WFDC2敲除小鼠表型分析

對(duì)WFDC2敲除小鼠的出生情況進(jìn)行觀察分析，記錄每一窩的出生胎鼠數(shù)量，基因型比例以及存活情況。

2 結(jié)果

2.1 TALEN載體構(gòu)建

小鼠Wfdc2基因有五個(gè)已知轉(zhuǎn)錄變異體，為了高效敲除WFDC2蛋白表達(dá)，本研究選擇的敲除位點(diǎn)為 Wfdc2基因的第一個(gè)外顯子區(qū)域，如圖 1。TAL-effector識(shí)別模塊 HD、NG、NI、NN分別識(shí)別堿基C、T、A、G，因此本研究中識(shí)別 Wfdc2的模塊序列分別為5'-NN HD NIHD HD NING NN HD HD NG NN HD HD NG NN-3'和TALEN-R 5'-NINN NN NI NN NN HD HD NINN HD NN NN HD HD NI-3'。采用Golden gate的方法[24]獲得了 TALENs體外轉(zhuǎn)錄模板，如圖2。

2.2 WFDC2敲除小鼠構(gòu)建及鑒定

圖1 Wfdc2基因敲除TALENs位點(diǎn)Fig.1 The TALENs binding site in the m ouse Wfdc2 gene

圖2 Wfdc2 TALENs識(shí)別臂的構(gòu)建Fig.2 The construction of Wfdc2 TALENs tem p late

體外轉(zhuǎn)錄分別得到 TALEN-L和TALEN-R的mRNA。將mRNA分別稀釋到100ng/μL后等量混合進(jìn)行胞質(zhì)注射，先注射15枚受精卵，進(jìn)行TALENs活性驗(yàn)證（圖3），驗(yàn)證TALENs有切割活性后，共注射140枚受精卵，移植131枚到5只ICR代孕雌鼠輸卵管中，共出生24只小鼠。對(duì)出生的24只F0代小鼠進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果顯示，有9只敲除陽(yáng)性小鼠（圖4），選取第24號(hào) F0代陽(yáng)性小鼠繼續(xù)繁育最終獲得敲除17個(gè)堿基的Wfdc2純合雙敲除模型。

2.3 WFDC2敲除小鼠的表型分析

得到24號(hào)F0代陽(yáng)性小鼠后，我們將它與野生型小鼠交配，F(xiàn)1代留下敲除17個(gè)堿基的雜合WFDC2敲除小鼠（WFDC2+/-），這些雜合小鼠能正常生長(zhǎng)，和野生型小鼠生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯的差別，WFDC2+/-小鼠自交，能正常懷孕產(chǎn)仔得到F2代小鼠，根據(jù)孟德爾第一定律，F(xiàn)2代小鼠中將出現(xiàn)野生型（WFDC2+/+），雜合（WFDC2+/-）及純合（WFDC2-/-）小鼠，并且 WFDC2+/+∶WFDC2+/-∶WFDC2-/-的比例應(yīng)為1∶2∶1。但是在 F2代小鼠出生后5 d我們對(duì)F2代小鼠編號(hào)及基因型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，存活的F2代小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)WFDC2-/-小鼠，只發(fā)現(xiàn) WFDC2+/+和 WFDC2+/-。這一結(jié)果說(shuō)明WFDC2-/-小鼠可能胚胎致死或者出生后死亡。

圖4 鑒定Wfdc2基因發(fā)生切割的小鼠Fig.4 Restriction digest of PCR p roducts used for identification of m ice carrying-induced m utations of the Wfdc2 gene

為驗(yàn)證 WFDC2-/-小鼠是否胚胎致死，我們對(duì)7只胚胎 18.5 d（E18.5）WFDC2+/-孕鼠進(jìn)行剖腹產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)E18.5 d孕鼠腹中胎兒中有 WFDC2-/-小鼠，并且未見死胎，其中野生型占總出生數(shù)量的29.58%，WFDC2+/-占 46.48%，WFDC2-/-占23.94%（表1），接近孟德爾第一定律1∶2∶1的比例。這一結(jié)果提示，WFDC2-/-小鼠可能在出生后死亡，經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察追蹤，我們發(fā)現(xiàn)，每窩新生胎兒中，都有一些新生小鼠尸體或殘骸，懷疑有的可能被母鼠吃掉。接著，我們對(duì)這些尸體或殘骸進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)這些死去的胎鼠是WFDC2-/-小鼠。為了防止母鼠將新生 WFDC2-/-小鼠吃掉，我們將剛出生的胎鼠立即與母鼠分開，對(duì)不同 WFDC2+/-自交所產(chǎn)生6窩新生小鼠出生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中50%的新生WFDC2-/-小鼠在5 h之內(nèi)死亡，所有新生WFDC2-/-小鼠在18 h內(nèi)死亡，而 WFDC2+/-小鼠和WFDC2+/+小鼠能正常存活下來(lái)（圖5）；在這些胎鼠中，WFDC2+/+占總出生數(shù)量的 23%，WFDC2+/-占 52%，WFDC2-/-占 25%（表 2），接近孟德爾第一定律；而 WFDC2+/-自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)和WFDC2+/+自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)之間沒有顯著差異（圖 6）。上述結(jié)果說(shuō)明非純合WFDC2敲除小鼠和野生型小鼠一樣具有正常的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖繁育能力，而純合 WFDC2敲除小鼠能夠正常出生，并在出生后死亡。

圖5 新生小鼠24 h內(nèi)生存曲線Fig.5 Survival curve for WT、hetero and KO fetus after birth w ithin 24 hours

表1 E18.5天胎鼠基因型分布情況Tab le 1 Genotype distribution of em bryos from E18.5

表2 新生小鼠基因型分布Tab le 2 Genotype distribution of neonatal from P0

圖6 WFDC2+/-自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)和WFDC2+/+自交后代每窩平均產(chǎn)仔數(shù)Fig.6 Summ ary of litter sizes born from WFDC2+/+and WFDC2+/-

3 討論

現(xiàn)今基因組編輯技術(shù)突飛猛進(jìn)，在TALEN基因編輯技術(shù)之后，又出現(xiàn)了CRISPER-Cas9基因編輯技術(shù)，因其操作周期短，效率高而被廣泛使用[23，25]。而TALEN也因其相對(duì)操作簡(jiǎn)單，特異性高等特點(diǎn)，仍被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物等的基因編輯。本研究通過(guò)胞質(zhì)注射TALEN mRNA的方法獲得了Wfdc2基因發(fā)生移碼突變的F0代小鼠，將該種小鼠單獨(dú)建系，繁育和培養(yǎng)，最后獲得純合的WFDC2敲除模型小鼠。

現(xiàn)今有關(guān)WFDC2功能的研究，特別是它在腫瘤發(fā)生過(guò)程中所起作用的研究越來(lái)越受人重視。許多研究都指出卵巢癌，肺癌等組織中HE4有異常高表達(dá)，并提出 HE4可以作為這些癌癥的檢測(cè)指示物。但HE4的高表達(dá)是促進(jìn)癌癥的發(fā)生還是由于癌癥的發(fā)生而導(dǎo)致HE4的高表達(dá)這個(gè)問(wèn)題仍然沒有定論。在目前的研究更傾向于HE4高表達(dá)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。Zhu等[16]通過(guò)沉默卵巢癌細(xì)胞中HE4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些癌細(xì)胞的增殖及遷移能力隨HE4的減少而降低，指出HE4的表達(dá)可能是維持腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的因子，并且Moore等[17]通過(guò)在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)HE4，證明HE4促進(jìn)卵巢腫瘤的發(fā)生。但是 Gao等[26]和 Kong等[27]卻指出 HE4在腫瘤中起著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。因此現(xiàn)階段關(guān)于HE4是否促進(jìn)腫瘤的發(fā)生的結(jié)論還需要更多的研究來(lái)證實(shí)。WFDC2除了在腫瘤組織中有高表達(dá)外，它在正常組織中也有表達(dá)。在人體正常組織中表達(dá)量從高到低的器官依次是氣管，唾液腺，肺；而在小鼠正常組織中表達(dá)量從高到低的器官依次是肺，腎等[4]器官，這些研究結(jié)果提示HE4可能參與調(diào)控體內(nèi)相關(guān)正常生理活動(dòng)。

本研究發(fā)現(xiàn)WFDC2純合敲除小鼠出生后死亡，而非純合WFDC2敲除小鼠能正常生長(zhǎng)和繁育?？赡艿脑蚴牵?）.純合WFDC2敲除小鼠在孕鼠母體內(nèi)能夠獲得來(lái)自母體血液的WFDC2，而出生后由于缺乏母體和自身合成的WFDC2而死亡。而非純合小鼠由于未全部失去自身合成WFDC2的能力而能在出生后正常存活并生長(zhǎng)發(fā)育。有趣的是，WFDC2在一些物種中高度保守[3]，成熟WFDC2蛋白分子量在13kD，在被糖基化修飾后為27kD左右，至于27kD的WFDC2是否能透過(guò)胎盤屏障而到達(dá)胎兒體內(nèi)還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2）.WFDC2表達(dá)可能具有時(shí)空性，在胚胎發(fā)育期或胚胎發(fā)育早期，WFDC2不參與相關(guān)生理活動(dòng)，在小鼠出生后 WFDC2參與并維持正常生理活動(dòng)，而純合敲除小鼠由于缺乏WFDC2表達(dá)而不能實(shí)現(xiàn)相關(guān)生理功能正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致死亡。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明WFDC2參與調(diào)控小鼠正常生理活動(dòng)，提示 WFDC2可能在維持胎兒正常生理功能中起著重要的作用，同時(shí)，通過(guò)研究HE4正常生理功能的作用機(jī)制，能更好的幫助我們理解它們?cè)诎┌Y發(fā)生中所起的作用。因此，本研究獲得的WFDC2敲除小鼠是研究WFDC2生理功能的良好模型。