銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠能量代謝的影響

周春霞 李 霞 樹俊蓮 徐 麗

（1.原武警總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合理療科，北京 100039）（2.原武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039）

銀杏內(nèi)酯 B（ginkgolide B，GB）是中藥銀杏葉的活性成分，具有抗過敏、抗炎、抗移植排斥反應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)活性[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GB對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌損傷具有保護(hù)作用[3-4]，然機(jī)制未明。本研究擬應(yīng)用心肌缺血/再灌注（myocardial ischem ia/reperfusion）損傷大鼠模型，探討GB保護(hù)心肌的作用機(jī)制是否與能量代謝有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

GB（純度≥90%）購自 Sigma公司，實(shí)驗(yàn)前用0.9%氯化鈉注射液配制成濃度0.08%、0.04%和0.02%，即給藥劑量 8 mg/kg體質(zhì)量、4 mg/kg、2 mg/kg。肌酸激酶（CK）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量200～240 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（冀）2008-1-003。本研究通過本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并在其監(jiān)督下進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 建立心肌缺血/再灌注大鼠模型：采用冠脈結(jié)扎術(shù)，參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。簡言之，將麻醉后的大鼠仰位固定，四肢連接十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)（日本光電工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，型號(hào) ECG-1350P）。頸部做氣管插管，連接小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)DW-3000），設(shè)呼吸頻率每分鐘60次，潮氣量20 mL/kg。于胸骨左旁第3肋和第4肋間開胸，用絲線撐開肋骨，暴露心臟，沿左心耳下緣冠脈前降支起始部約4 mm處用帶線縫合針進(jìn)針，深度控制在約 1 mm，將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于縫合線下，之后結(jié)扎縫合線致大鼠心肌缺血。缺血30 min左右觀察到心電圖ST段明顯抬高或T波高聳后，松開縫合線再灌注2 h（觀察到心電圖抬高的ST段下降1/2以上或高聳的T波下降，視為再灌注成功）。

1.3.2 分組與給藥：將大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、GB高劑量組、中劑量組、低劑量組，各組于術(shù)前1 h和再灌注即刻分別尾靜脈注射給予1/2量的藥物，假手術(shù)組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。假手術(shù)組10只大鼠僅開胸不結(jié)扎冠脈，其他各組則每組均抽取術(shù)后成模大鼠10只進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 測定血清心肌酶活性：再灌注結(jié)束后，動(dòng)物經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，常規(guī)2 500 r/m in離心10 min分離血清，采用比色法分別于紫外/可見分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào) UV-2550）660 nm和440 nm下測定A值，并計(jì)算 CK、LDH活性，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.4 測定心肌ATP酶活力：采血后，各組取部分心臟，生理鹽水洗凈血跡，用組織勻漿機(jī)（德國IKA集團(tuán)，型號(hào)T10）制成勻漿，3 500 r/min離心10 min得上清。采用定磷法于紫外/可見分光光度計(jì)660 nm下測定A值，并計(jì)算ATP酶活力；心肌勻漿上清液的蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法定量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.5 測定心肌梗死面積（MIS）：各組取心臟，用生理鹽水洗后，去除血管、脂肪及心房組織，從冠脈結(jié)扎線下方至心尖處將心室平行切成厚度相等的5片，置于0.1%NBT溶液中，37℃染色15 min。以數(shù)碼相機(jī)采集圖像（正常心肌呈藍(lán)色，梗死心肌則呈灰白色），采用ImagePro Plus 7.0軟件測算心室總面積和梗死區(qū)面積，并計(jì)算 MIS（%）[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05定為檢驗(yàn)顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 各組M IS情況

模型組動(dòng)物MIS達(dá)20.12%，GB預(yù)處理可不同程度地縮小 MIS，其中高劑量組的 MIS縮小至16.20%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.75，P＜0.05）。假手術(shù)組因未出現(xiàn)心肌梗死，MIS未納入統(tǒng)計(jì)學(xué)比較（圖1）。

圖 1 各組 M IS比較（±s ±s，n=10）Fig.1 The com parison of m yocardial in farction size（±s±s，n=10）

2.2 各組心肌酶活性情況

假手術(shù)組動(dòng)物血清CK、LDH活性分別為0.26、1.03 U/m L；與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物血清 CK活性顯著升高為 0.77 U/mL（t=16.38，P＜0.01），血清LDH活性顯著升高為2.99 U/m L（t=10.98，P＜0.01）；GB預(yù)處理可不同程度地降低血清CK和LDH活性，低、中、高劑量組 CK活性分別為0.69、0.64、0.63 U/mL，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.22，P＜0.05或 P＜0.01）；高劑量組 LDH活性為2.20 U/m L，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.47，P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組血清 CK和 LDH活性比較（±s±s，n=10）Fig.2 The com parison of CK and LDH activities in serum （±s ±s， n=10）

2.3 各組ATP酶活力情況

假手術(shù)組動(dòng)物心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力分別為 4.06、5.75 mmol Pi/g。模型組動(dòng)物心肌組織Na+/K+-ATP酶活力顯著降低為3.09 mmol Pi/g，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.99，P＜0.01），Ca2+/Mg2+-ATP酶活力顯著降低為3.97 mmol Pi/g，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.58，P＜0.01）；GB預(yù)處理可不同程度地影響ATP酶活力，與模型組比較，高、中劑量組可顯著升高 Na+/K+-ATP酶活力為3.69、3.78 mmol Pi/g（F=2.16，P＜0.05），高、中、低劑量組可顯著升高Ca2+/Mg2+-ATP酶活力為4.50、4.79、4.81 mmol Pi/g（F=2.84，P＜0.05 或P＜0.01）（圖 3）。

圖3 各組心肌組織ATP酶活力比較（±s±s，n=10）Fig.3 The com parison of ATPase activities in m yocard ial tissue（±s ±s，n=10）

3 討論

采用藥物預(yù)處理的方式可促使機(jī)體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活機(jī)體自身保護(hù)機(jī)制，進(jìn)而增強(qiáng)心肌缺血/再灌注損傷心肌組織對(duì)缺血、缺氧的耐受，實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用[7]。本研究觀察了GB預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示GB通過預(yù)處理給藥能顯著縮小心肌梗死面積（P＜0.05），這與白志超等[8]的報(bào)道結(jié)果一致。

當(dāng)心肌缺血/再灌注發(fā)生導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜受損時(shí)，心肌細(xì)胞中的蛋白酶CK和LDH外漏增加，其釋放入血的量與心肌壞死程度呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物血清CK和LDH活性顯著升高，反映出心肌缺血/再灌注心肌細(xì)胞損傷的程度；GB預(yù)處理可顯著降低血清CK和LDH活性，提示GB可通過提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而保護(hù)受損的心肌組織。

能量代謝是心肌細(xì)胞活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前認(rèn)為能量代謝障礙是心肌缺血/再灌注損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)和損傷進(jìn)一步加重的原因之一[10]，ATP酶活力則可反映細(xì)胞的能量水平，在缺血性心臟病的研究中受到重視。心肌缺血/再灌注發(fā)生時(shí)，線粒體受損，ATP生成減少，使心肌細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)上Na+/K+-ATP酶活力降低，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高和酸中毒，通過 Na+-H+交換使細(xì)胞內(nèi) Na+進(jìn)一步增多，Na+超負(fù)荷會(huì)激活細(xì)胞膜上的Na+-Ca2+交換蛋白，使 Ca2+內(nèi)流增多；同時(shí)肌漿網(wǎng)上 Ca2+/Mg2+-ATP酶活力降低，胞內(nèi)Ca2+攝取減少造成細(xì)胞內(nèi)外Ca2+和Mg2+分布失衡，更加重了細(xì)胞內(nèi)鈣超載[11]。鈣超載則會(huì)觸發(fā)一系列的細(xì)胞損傷機(jī)制如加重線粒體損傷進(jìn)而加重心肌細(xì)胞的能量缺乏，激活磷脂酶使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，激活蛋白水解酶進(jìn)而引起遲發(fā)性細(xì)胞死亡等[12]。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血30 m in再灌注2 h后，心肌組織中 Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力顯著降低，說明此時(shí)心肌出現(xiàn)能量代謝障礙，細(xì)胞功能受抑；GB預(yù)處理則可明顯提高心肌組織中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子平衡尤其是Ca2+穩(wěn)態(tài)，改善心肌組織的能量代謝障礙。

綜上，GB預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護(hù)作用是通過保護(hù)細(xì)胞膜ATP酶活力、改善能量代謝等途徑實(shí)現(xiàn)的；至于GB具體作用于能量代謝的哪個(gè)環(huán)節(jié)，尚需進(jìn)一步研究。