高效液相色譜法測定蜂蜜中氯霉素殘留

■ 張微微 文奇男 殷慶慶 柴新義 董藝凝*

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000；2.沈陽市友發(fā)實(shí)業(yè)有限公司，遼寧沈陽110144）

氯霉素是一種廣譜抗生素，由于其價(jià)格便宜、療效快，被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)品疾病的預(yù)防與治療[1]。但因其自身無法代謝，在畜禽體內(nèi)大量積累，發(fā)生嚴(yán)重副作用，因此各國對(duì)氯霉素藥物在動(dòng)物產(chǎn)品中做了嚴(yán)格的殘留限量，如歐盟規(guī)定動(dòng)物身體中的氯霉素殘留量絕對(duì)不能超過0.01 mg/kg[2-3]。

隨著畜牧業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，導(dǎo)致疾病傳播率高，病菌種類多，畜禽臨床治療十分棘手[4]。而作為新型飼料資源的蜂蜜等主要蜂產(chǎn)品，由于其天然性、營養(yǎng)性、無抗性、排泄物少等特點(diǎn)，必然受到畜牧業(yè)的青睞[4-5]。研究指出飼用蜂蜜可以促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能，還可以提高免疫力，抑制腸道致病菌群的生長等作用[4，6]。但因病蟲害、氣候等外界因素影響使得蜜蜂人工飼料中濫用藥物，造成蜂蜜中氯霉素含量超標(biāo)，使得其飼用價(jià)值受到一定的威脅。

目前，測定氯霉素殘留量的方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[7]、氣相色譜法（GC）[8]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[10-19]和液相色譜法（LC）[20-22]、毛細(xì)管電泳法[23]等多種方法。ELISA法和毛細(xì)血管法快速簡單，但只適合初篩，靈敏度低，無法做限量驗(yàn)證。質(zhì)譜檢測精確，但耗時(shí)長，樣品前處理復(fù)雜，檢測成本過高，不宜推廣。當(dāng)前的HPLC法由于樣品處理繁瑣，誤差較大限制了方法的通用性。因此，本研究開發(fā)一種簡單快捷、經(jīng)濟(jì)適用性強(qiáng)的高效液相色譜測定蜂蜜中的氯霉素方法，為快速測定飼用蜂蜜氯霉素含量奠定理論指導(dǎo)作用，也為畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)提供了保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品，甲醇（HPLC級(jí)色譜純），乙腈、蒸餾水、乙酸乙酯、NaCl、MgSO4、NaOH、醋酸銨、磷酸氫二銨均為國產(chǎn)分析純，蜂蜜（5種不同品牌）購自超市。

1.2 主要儀器設(shè)備

天瑞高效液相色譜儀（配有紫外檢測器；江蘇天瑞公司）、xbridge TMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、50 μl微量進(jìn)樣器、離心機(jī)、漩渦混勻器、超聲波儀、水浴鍋、氮吹儀、移液管、圓底燒瓶、分液漏斗、鐵架臺(tái)、1 ml注射器、有機(jī)膜和水膜。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.3.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

首先稱取25 mg的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品放置于25 ml的容量瓶中，接著用甲醇定容至刻度線，此時(shí)氯霉素的質(zhì)量濃度就是1 mg/ml。然后取2.5 ml濃度為1 mg/ml的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此時(shí)的質(zhì)量濃度為100 μg/ml。然后按梯度稀釋，配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為10、5、2、1 μg/ml和 0.1 μg/ml。最后將濃度為 10、5、2、1 μg/ml和0.1 μg/ml的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)于冰箱中備用。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：xbridge TMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、檢測波長278 nm、柱溫40℃、流速0.8 ml/min、進(jìn)樣量20 μl。流動(dòng)相比例：V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氫二銨緩沖液，pH值5.0）=40∶60。

依據(jù)以上色譜條件，檢測流動(dòng)相pH值、流速、樣品前處理等因素對(duì)氯霉素分離效果的影響，確定最終色譜條件。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定、精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、回收率測定考察儀器方法精密性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

1.3.3 蜂蜜樣品前處理

① 方法1：先用NaOH進(jìn)行堿化蜂蜜樣品，再用乙酸乙酯來萃取蜂蜜中的氯霉素。

先稱取10 g的蜂蜜樣品于50 ml的塑料離心管中，接著加入5 ml蒸餾水，用漩渦儀震蕩混勻，再加入20 ml的乙酸乙酯溶液，渦旋2 min使其充分混勻。再超聲水浴鍋中超聲振蕩30 s，分別快速加入2.0 g干燥NaCl和1 g NaOH，并立即渦旋振蕩2 min混勻，無磚紅色沉淀最好，超聲水浴提取2 min。4 000 r/min離心5～10 min，分離取上清液。再次向剩下的殘留物中添加20 ml乙酸乙酯，重復(fù)兩次上述提取步驟，將上層提取液合并在100 ml的三角燒瓶中。35℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 ml乙腈把白色殘留物從蒸發(fā)皿的壁上轉(zhuǎn)移到5 ml離心管中，再加入0.15 g MgSO4，并振蕩30 s。4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心1～2 min，將清液倒入于進(jìn)樣瓶中，用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后的溶液用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析測定。

②方法2：樣品先用水溶解再用乙酸乙酯來提取、最后用氮?dú)獯蹈蓙硖崛÷让顾亍?/p>

先稱取適量待測樣品15 g，放入100 ml的三角燒瓶中，然后加人30 ml乙酸乙醋，用漩渦儀旋渦振搖混合均勻后，用超聲提取儀進(jìn)行超聲提取3 min。接著用分液漏斗移出上清液，再向剩下的殘?jiān)屑尤诉m量乙酸乙酯，與上述操作相同，提取兩次，超聲提取時(shí)間可以隨著提取次數(shù)的增加逐漸遞減，三次所得上清溶液合并入圓底燒瓶，于80℃水浴蒸發(fā)成快干狀態(tài)，剩余的溶液再用氮?dú)獯蹈?，瓶中殘留的白色物質(zhì)加水振搖溶解，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后高效液相色譜儀進(jìn)樣分析測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜方法的建立

2.1.1 流速優(yōu)化

一般情況下流速由色譜柱的內(nèi)徑大小直接來決定的，內(nèi)徑比較大的就會(huì)選擇較大流速，這樣樣品在色譜柱中停留分析的時(shí)間就會(huì)相對(duì)較短，內(nèi)徑較小的就會(huì)選擇較小流速，一般來說流速對(duì)色譜分離效果的影響程度不是很大。提高樣品在柱子中的流速可以提高分析的速度，但是樣品在柱子中的流速根據(jù)其性質(zhì)不同也會(huì)有不同的最大限制速度。降低樣品在柱子中的流速雖然可以提高樣品組分間的分離度，但是會(huì)延長分離的時(shí)間并且降低柱子的效能。本實(shí)驗(yàn)通過研究流速對(duì)色譜分離及其影響，并且對(duì)于流速的影響做了全面而又細(xì)致的考察。最后選擇當(dāng)pH值相同時(shí)，0.7、0.8 ml/min這兩種不同流速作為考察對(duì)象，考察了不同流速對(duì)分離時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，當(dāng)流速為0.7 ml/min時(shí)，出峰時(shí)間為11.46 min，峰圖有稍微的拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流速為0.8 ml/min時(shí)，出峰時(shí)間為10.08 min，峰圖的拖尾現(xiàn)象不明顯。相比而言當(dāng)流速為0.8 ml/min時(shí)，它的出峰時(shí)間有所縮短，峰圖效果較好，因此本實(shí)驗(yàn)研究選擇流速為0.8 ml/min。

2.1.2 流動(dòng)相及pH值的選擇

圖1 流速為0.7 ml/min時(shí)的色譜圖

圖2 流速為0.8 ml/min時(shí)的色譜圖

C18柱是作為一種反相填料最為常見，其表面殘留的硅羥基pka約為4.7，采用磷酸鹽作為流動(dòng)相時(shí)需要在其中加入酸，使流經(jīng)C18柱的流動(dòng)相pH值在5以下，就會(huì)抑制流動(dòng)相中硅羥基的解離，從而調(diào)節(jié)目標(biāo)物分子狀態(tài)，獲得良好蜂形。從分子結(jié)構(gòu)上可以看出氯霉素分子中含有氨基和羥基，所以流動(dòng)相的解離狀態(tài)和流動(dòng)相的pH值是密切相關(guān)的，因此控制流動(dòng)相pH值，使其在色譜柱上獲得良好的保留從而顯現(xiàn)較好的峰型是十分重要。

本實(shí)驗(yàn)研究中考察了在相同的流動(dòng)相情況下，流動(dòng)相不同的pH值，其分別為4.0、4.5、5.0時(shí)，氯霉素的提取狀況，不同的pH提取效果見圖3、圖4、圖5。

圖3 pH值4.0時(shí)的色譜圖

圖4 pH值4.5時(shí)的色譜圖

圖5 pH值5.0時(shí)的色譜圖

當(dāng)pH為4.0的時(shí)候，濃度為2 μg/ml氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是10.27 min。峰圖有稍微的拖峰現(xiàn)象。

當(dāng)pH為4.5的時(shí)候，濃度為2 μg/ml氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是10.58 min。峰圖有稍微的拖峰現(xiàn)象。

當(dāng)pH值為5.0的時(shí)候，濃度為2 μg/ml氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是10.08 min。峰圖無明顯的拖峰現(xiàn)象。由上面三幅對(duì)比圖可見pH值為5.0時(shí)氯霉素樣品的峰型最好，儀器的靈敏度也明顯提高，出峰時(shí)間有所縮短。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 方法初確定

實(shí)驗(yàn)之前大致選擇了兩種方法作為選擇進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)（方法見1.3.3），對(duì)所得樣品前處理產(chǎn)物進(jìn)行色譜分析，分析條件見1.3.2，實(shí)驗(yàn)所得的色譜圖如圖6所示。

由上圖6可見，方法1其色譜圖的分離程度不高，方法2色譜圖的峰形較好，因此選擇第二種方法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.2.2 方法的進(jìn)一步確定與優(yōu)化

由于樣品前處理添加水的體積和提取時(shí)加的乙酸乙酯的量對(duì)氯霉素的提取濃度有影響，本實(shí)驗(yàn)利用兩因素三水平實(shí)驗(yàn)，研究這兩種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果分析如表1所示。

用statistic分析表中數(shù)據(jù)，P＜0.05差異有顯著意義。由表1可知，當(dāng)蜂蜜∶水=2∶1，蜂蜜∶乙酸乙酯=1∶2時(shí)，所提取氯霉素濃度最高，提取效果較好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在采用高效液相色譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析時(shí)，需要制作出工作曲線。將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.3.1中方法制備）用1.3.2中所述的色譜條件進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確吸取濃度為0.1、1、2、5 μg/ml和 10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液 20 μl，用有機(jī)膜過濾后注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中的數(shù)據(jù)并計(jì)算，測定峰面積。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性擬合，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=4 236.2X-814.96，在 0.1～10.0 μg/ml濃度范圍相關(guān)系數(shù) R2為0.999 5，線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)與檢出限

精密吸取標(biāo)液10 μg/ml，平行測定5次，然后計(jì)算各組分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%。

式中：CL——檢出限；

M——標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率；

Sb——為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差；

K——置信因子。

根據(jù)上述公式計(jì)算出檢出限為0.001 mg/kg，均滿足分析要求。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

圖6 方法色譜圖

表1 兩因素三水平分析水和乙酸乙酯對(duì)提取氯霉素的影響（μg/g）

稱取蜂蜜樣品5份，每份15 g，按1.3.3樣品處理方法操作，測定峰面積，計(jì)算含量，獲取RSD為0.5%。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知氯霉素濃度的蜂農(nóng)蜂蜜15 g向其中添加濃度分別為130、260、660 μg/kg的氯霉素溶液各2 ml進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按1.3.3第二種方法進(jìn)行樣品前處理，按1.3.2中V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氫二銨緩沖液，pH值5）=40∶60的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次。氯霉素回收率結(jié)果見表2。其回收率為84%～93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.2%，滿足線性分析要求。

表2 蜂蜜中添加不同濃度標(biāo)樣所測回收率

3 結(jié)論

為了將本方法應(yīng)用于市場，我們對(duì)市場上的蜂蜜樣品進(jìn)行抽檢，共抽檢了5份。樣品檢出80%略超出我國規(guī)定蜂蜜中氯霉素的檢出量（＜0.3 mg/kg），差異不顯著，但是高攝取會(huì)造成一定藥物殘留。通過以上研究得出，蜂蜜樣品需將水與蜂蜜（1∶2）混合，制作成蜂蜜水溶液，然后用乙酸乙酯與蜂蜜水溶液（2∶1）萃取氯霉素，接著用氮?dú)獯蹈?，再以水溶解樣品。該樣品前處理方法簡單，得率較高。其次，色譜優(yōu)化條件為：0.2%的甲醇-磷酸鹽緩沖液（40∶60）為流動(dòng)相，流速為0.8 ml/min，柱溫40℃，紫外線檢測波長為278 nm。采用本方法進(jìn)行檢測時(shí)，氯霉素的檢出限為0.001 mg/kg，在0.1～10.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，呈良好的線性關(guān)系。本結(jié)果為飼用蜂蜜中氯霉素殘留量測定提供了一種簡便快捷并且準(zhǔn)確的色譜方法，并對(duì)畜禽業(yè)的安全生產(chǎn)提供了保障。