凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白制備及其雙向電泳體系的建立

■范蘭芬 王安利

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東廣州510642；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631）

蛋白質(zhì)組（Proteome）是由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams等人于1994年提出，廣義上指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)以基因編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對象，從整體水平研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入了解有機(jī)體的各種生理和病理過程。因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可能更好地幫助人們了解生命的本質(zhì)，各器官的分子結(jié)構(gòu)、功能及其行使該功能的機(jī)制等。它是一個(gè)動態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞的活動規(guī)律。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)及海洋動物的研究中。其中雙向凝膠電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最基本的試驗(yàn)手段。凡納濱對蝦的血細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，又是體液免疫因子的提供者，因此在免疫系統(tǒng)中起著重要作用，一直是研究的熱點(diǎn)。該研究以凡納濱對蝦血細(xì)胞為研究對象，建立雙向電泳圖譜及技術(shù)體系，為進(jìn)一步探索凡納濱對蝦的生理生化機(jī)制，進(jìn)行生物質(zhì)譜鑒定提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和材料

Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；PowerWave XS微孔板酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；美國伯樂protean IEF Cell等電聚焦電泳儀，美國伯樂垂直電泳儀，冷卻水循環(huán)系統(tǒng)；美國伯樂IPG預(yù)制膠條（線性pH值3～10，17 cm；線性pH值4～7，17 cm；線性pH值5～8，17 cm）；二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、過硫酸銨、礦物油、碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)等（Sigma公司）；其他常見試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。所用試劑均采用Milli-Q水配置。

所用凡納濱對蝦[平均體重（6～7）g]購于番禺魚窩頭養(yǎng)殖場。對蝦購入后暫養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，環(huán)境條件為溫度28℃、養(yǎng)殖水鹽度為5‰。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)2周左右使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境。

1.2 蛋白質(zhì)樣品制備及定量

取血前將凡納濱對蝦置于冰上，使其處于休眠狀態(tài)，活動力下降，以便取血。以1 ml的一次性注射器由對蝦第一腹節(jié)基部血竇抽取血淋巴液，所有過程均在冰上完成，所采得的血淋巴液加入等體積的抗凝劑(27 mmol/l檸檬酸鈉、385 mmol/l氯化鈉、115 mmol/l葡萄糖，pH值7.5)。均勻混合后立即以3 000 r/min、4℃離心10 min，舍棄上清液，所得沉淀為血細(xì)胞，分裝并保存于超低溫冰箱備用。

蛋白質(zhì)的制備方法設(shè)2組，A組：裂解法，每份血細(xì)胞樣品加入1 ml裂解液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，20 mmol/l Tris-HCl，30 mmol/l DTT，2%v/v兩性電解質(zhì))，用勻漿機(jī)在冰上進(jìn)行裂解組織操作，每勻漿15 s停15 s以防過熱，離心(4 ℃、12 000 r/min、15 min)，取上清液備用；B組：丙酮沉淀法，取A中上清250 μl，加入4倍體積10%TCA/丙酮溶液（含0.07%DTT）沉淀蛋白質(zhì)，-20℃放置過夜，離心(4℃、12 000 r/min、15 min)，吸去上清液，沉淀用預(yù)冷丙酮洗3次，室溫晾干。蛋白沉淀中加入500 μl裂解液，用移液器將蛋白質(zhì)沉淀反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)充分溶解。4℃、12 000 r/min、離心15 min，取上清液備用。

蛋白定量采用Bradford法，波長595 nm測定蛋白濃度，用標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對制備樣品蛋白溶液定量。

1.3 血細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的雙向電泳

1.3.1 第一向等電聚焦

將-20℃保存的膠條室溫下復(fù)溫10 min，分別取200、300 μg的蛋白質(zhì)樣品，用水化上樣緩沖液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，10 mmol/l DDT，0.5%v/v IPG緩沖液(pH值3～10、pH值4～7或pH值 5～8，IPG 預(yù)制膠條)，0.002%的溴酚藍(lán))補(bǔ)充至340 μl體積，混勻后加入水化盤的槽中。膠條膠面向下輕放入槽中，膠條表面加入1 ml礦物油防止樣品揮發(fā)。等電聚焦程序儀器運(yùn)行參數(shù)設(shè)定為30 V水化12 h，200 V線性1 h，500 V快速1 h，1 000 V快速1 h，10 000 V線性30 min，10 000 V快速直至80 000 Vh，每根膠條的極限電流50 A。

1.3.2 膠條的平衡

等電聚焦完成后，取出膠條，用濾紙吸取膠條表面多余液體，依次放入平衡液Ⅰ[50 mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH值8.8)，6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚藍(lán)、1%DTT]和平衡液Ⅱ[50 mmol/l Tris-HCl緩沖液 (pH值8.8)、6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚藍(lán)、2.5%碘乙酰胺]中，于搖床上分別平衡15 min。

1.3.3 第二向SDS-PAGE垂直電泳

采用12.5%的SDS-PAGE電泳。將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，用0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液(Tris 5 mmol/l、Gly 192 mmol/l、SDS 0.1%)。先以120 V電泳30 min，然后240 V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底邊處停止電泳，總時(shí)間約為5 h。

1.3.4 凝膠染色

電泳結(jié)束后，采用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。

1.3.5 圖像分析

凝膠通過Image scanner雙向電泳凝膠專用透射掃描儀進(jìn)行掃描獲取高精度2-DE凝膠圖像，儀器分辨率設(shè)置為300 dpi、8 bits深度，保存圖像格式為tiff，一次掃描為真彩256色和灰度兩種模式分別用于圖譜分析。PDQuest 2-DE凝膠圖像分析軟件進(jìn)行點(diǎn)檢測、數(shù)目統(tǒng)計(jì)、凝膠匹配等處理。

2 結(jié)果

2.1 蛋白濃度測定

采用Bradford方法測定樣品在595 nm處的OD值。檢測標(biāo)準(zhǔn)蛋白在595 nm處的OD值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1)，得到線性方程y=0.740 5x+0.458，R2=0.996。根據(jù)此方程測得對蝦血細(xì)胞蛋白濃度為3.820 4 μg/μl，據(jù)此推算雙向電泳的蛋白上樣量。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 血細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳

2.2.1 寬范圍IPG膠條的電泳圖譜

采用寬范圍IPG(pH值3～10)膠條對凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)的總體分布情況進(jìn)行了分析(如圖2)，2-DE凝膠圖譜顯示凡納濱對蝦的血細(xì)胞蛋白質(zhì)主要分布在pH值4～8之間，中性蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較多，偏酸偏堿的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)非常少，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條，以提高蛋白質(zhì)的分辨率。

2.2.2 窄范圍IPG膠條的電泳圖譜

采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條對凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)的總體分布情況進(jìn)行了分析(如圖3)，經(jīng)軟件對比分析得出凡納濱對蝦的血細(xì)胞蛋白質(zhì)主要分布在pH值5～8之間，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，以便利于蛋白點(diǎn)的分散并提高分辨率。

2.3 不同上樣量的雙向電泳圖譜

通過對雙向電泳的上樣量進(jìn)行摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高的上樣量（300 μg）導(dǎo)致高豐度蛋白區(qū)域蛋白堆積情況嚴(yán)重（如圖4），高豐度蛋白斑點(diǎn)過大也會影響其它蛋白斑點(diǎn)的分離和分析。對上樣量調(diào)整至200 μg，所獲圖譜背景較清晰，蛋白點(diǎn)分辨率較高，高豐度蛋白對其它蛋白質(zhì)的影響降低。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，均采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，上樣量200 μg，銀染。

圖2 寬范圍IPG膠條的血細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖3 窄范圍IPG膠條的血細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中樣品制備的關(guān)鍵性

樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)。要獲得高分辨率、有效性、可靠性和高重復(fù)率的雙向電泳圖譜，蛋白樣品的制備是關(guān)鍵。常用的雙向電泳蛋白樣品制備方法有裂解法、10%TCA/丙酮沉淀法、2D Cleanup沉淀法等。10%TCA/丙酮沉淀法是非常有效的蛋白質(zhì)沉淀方法，除去TCA時(shí)需要加入足夠量的丙酮溶液反復(fù)清洗，這樣才能制備提純的蛋白樣品，獲得較理想的2-DE圖譜。從雙向電泳圖譜結(jié)果看，10%TCA/丙酮沉淀法制備的蛋白可減少圖譜中的橫紋、縱紋，推測這與該方法制備的蛋白樣品中去除了許多干擾物質(zhì)相關(guān)。另外，10%TCA/丙酮沉淀法與2D Clean-up沉淀法等其它試劑盒提取法相比，具有成本低、操作便捷等優(yōu)勢。

圖4 窄范圍IPG膠條的血細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖5 窄范圍IPG膠條的血細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中膠條選擇的重要性

在雙向電泳實(shí)驗(yàn)中，選擇合適pH值范圍的膠條對于蛋白點(diǎn)的分散與篩選非常重要。根據(jù)所分離的蛋白樣品，可以選擇不同pH值范圍的固相pH值梯度膠條。本研究首先采用pH值3～10的較寬范圍的線性梯度膠條對凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，得到pH值3～10范圍的凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜。經(jīng)圖譜分析顯示凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白大部分分布在pH值4～8之間。雖然pH值3～10的寬范圍膠條能夠在一張凝膠圖譜上顯示更多的蛋白質(zhì)，但分辨率較低，可能會造成部分低豐度蛋白質(zhì)的丟失，因極酸性與極堿性端蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，因此，后續(xù)采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，經(jīng)軟件分析雙向電泳圖譜得出凡納濱對蝦的血細(xì)胞蛋白主要分布在pH值5～8之間，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，以便利于蛋白點(diǎn)的分散并提高分辨率。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中其他因素的影響

在雙向電泳的實(shí)驗(yàn)流程中，等電聚焦、上樣量選擇等也影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。等電聚焦關(guān)系著蛋白點(diǎn)的分散。一般在等電聚焦前膠條溶脹有兩種方式：主動溶脹和被動溶脹。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用主動溶脹，試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定，故選用主動溶脹方式。蛋白質(zhì)樣品的上樣量也是影響雙向電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)，提高上樣量，利于更多低豐度蛋白點(diǎn)檢出，但高豐度蛋白點(diǎn)過大，交叉重疊，又會掩蓋其它蛋白點(diǎn)分離。蛋白上樣量太少，容易造成某些蛋白點(diǎn)模糊甚至缺失，選擇一個(gè)合適的上樣量非常重要。本研究中，針對17 cm的線性 IPG 膠條(pH值 5～8)分別進(jìn)行了 300 μg與200 μg血細(xì)胞蛋白質(zhì)的上樣量的摸索，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)上樣量為200 μg左右，采用銀染可以獲得較好的雙向電泳圖譜。

綜上所述，該研究建立的凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳體系：裂解液提取血細(xì)胞蛋白質(zhì)，10%TCA/丙酮沉淀法制備蛋白質(zhì)樣品，采用17 cm pH值5～8的預(yù)制IPG膠條進(jìn)行第一向等電聚焦，濃度為12.5%的凝膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，采用銀染染色法制備凝膠圖譜。采用該體系能夠?qū)⒎布{濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)充分分離，得到斑點(diǎn)清晰、分辨率高的雙向電泳圖譜，為凡納濱對蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。