microRNA對哺乳動物卵泡發(fā)育的影響

李 琴

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460; 2.重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

卵巢是一個動態(tài)發(fā)育的生殖器官，卵巢上的卵泡由顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞構(gòu)成，3種不同類型細(xì)胞之間的相互作用是維持卵泡正常發(fā)育的前提。隨著卵母細(xì)胞體積增加和發(fā)育成熟，其周圍的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞也隨之增殖和分化，為分泌或應(yīng)答性激素做準(zhǔn)備[1]，而顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的分化是促使體內(nèi)卵泡快速生長的主要原因[2]。在下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamo-pituitary-ovarian axis，HPG)調(diào)控下，顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞能夠合成多種激素(包括雄激素、雌激素等)及生長因子，并表達(dá)受體，通過間隙連接，為卵母細(xì)胞的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟[3]。顆粒細(xì)胞決定著卵泡最終命運，卵泡的閉鎖首先由顆粒細(xì)胞啟動，當(dāng)大多數(shù)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡時，卵泡正在或已經(jīng)閉鎖[4]。這些研究表明，顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育、增殖、凋亡及類固醇激素合成中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類短序列的非編碼RNA，其主要調(diào)控方式是通過互補(bǔ)結(jié)合其靶基因3′UTR，從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用[5]。研究表明，miRNA在卵泡發(fā)育[6-8]、卵泡募集和選擇[9-10]、顆粒細(xì)胞增殖凋亡[11-16]，類固醇激素合成分泌[17-19]等方面發(fā)揮著重要作用。目前研究主要集中在miRNA對顆粒細(xì)胞增殖、凋亡以及類固醇激素合成分泌的影響。本文對miRNA與哺乳動物卵泡發(fā)育最新研究進(jìn)展，包括miRNA表達(dá)譜篩選鑒定、miRNA調(diào)控卵泡發(fā)育、miRNA對顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞增殖、凋亡、類固醇激素合成分泌等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 卵巢miRNAs表達(dá)譜鑒定

miRNAs是卵巢中最為豐富的內(nèi)源性小RNAs分子[20-21]。得益于基因芯片、二代測序等高通量測序技術(shù)，人們鑒定了不同物種卵巢組織中大量的miRNAs，包括鼠[22]、人[23]、牛[24]、羊[25]、豬[26]、雞[27]、鵝[28]等物種， 發(fā)現(xiàn)miRNAs在卵巢組織中可能發(fā)揮著重要的作用。Li等[26]通過深度測序的方法，鑒定了豬卵巢和睪丸組織的miRNAs，檢測到582個前體miRNAs編碼732個成熟的miRNAs，其中224個是卵巢和睪丸差異表達(dá)miRNAs， miRNAs主要位于X染色體上(X-連鎖miRNAs)，這些X-連鎖miRNAs偏好表達(dá)在睪丸中。Bonnet等[29]利用激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection, LCM)的方法分離了初生綿羊的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞，從顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中分別鑒定了1 050和759個特異組織表達(dá)的miRNAs，采用qRT-PCR方法鑒定了卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞特異表達(dá)的基因，此項研究為了解早期卵泡亞功能單位的基因調(diào)控提供較全面的視野。Gebremedhn等[30]采用Illumina測序技術(shù)，對牛發(fā)情周期后期排卵前優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡中顆粒細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了分析，分別在優(yōu)勢卵巢和從屬卵泡中發(fā)現(xiàn)了315、323個已知的miRNAs和11個新的miRNAs。其中，64個miRNAs顯著表達(dá)在排卵前優(yōu)勢卵泡中，60個在優(yōu)勢卵泡中顯著下降。通過基因富集分析表明，這些miRNAs可能參與腫瘤生成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝，并利用雙熒光素報告系統(tǒng)分析和驗證了miR-183與靶基因FOXO1的作用。Yu 等[28]通過高通量測序方法，分別對產(chǎn)蛋和就巢卵巢和等級前卵泡microRNA進(jìn)行表達(dá)譜的分析鑒定，發(fā)現(xiàn)let-7家族、miR-10家族和miR-143家族在卵泡發(fā)生中起決定作用。對差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析表明，這些基因參與了軸突導(dǎo)向、癌癥通路、細(xì)胞黏附、MAPK通路以及細(xì)胞與細(xì)胞因子受體作用。

目前，關(guān)于卵巢microRNAs表達(dá)譜研究在各個物種上已全面展開，從對整個卵巢組織到以顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞以及卵母細(xì)胞為對象，從整體水平上更加細(xì)致和深入地了解miRNA在卵巢、卵泡發(fā)育以及卵泡亞功能單位的作用；以miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及功能分析為基礎(chǔ)，通過分子生物學(xué)技術(shù)，驗證關(guān)鍵候選miRNA在卵泡發(fā)育中的功能及調(diào)控機(jī)制，是miRNAs后續(xù)研究的主要內(nèi)容和方向。

2 miRNA在卵泡發(fā)育中的作用

2.1 miRNA在早期卵泡發(fā)生中的作用

目前，已初步闡明，miR-143、miR-145、miR-376a對鼠胎兒期和初生期卵巢原始卵泡的形成和維持起重要作用[6-8]。miR-143能夠增加鼠胎兒期(從交配后15.5 d～初生后4 d)原始卵泡的數(shù)量。通過研究miR-143在體外培養(yǎng)鼠胎兒卵巢中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-143通過降低前顆粒細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制原始卵泡的形成[8]。TGFβ在調(diào)控原始卵泡～初級卵泡發(fā)育的過程中起重要作用，miR-145可通過促進(jìn)初生鼠卵巢中TGFβ受體(TGFβR)調(diào)控卵泡的發(fā)生[31]。抑制miR-145的表達(dá)能夠降低原始卵泡的比例和數(shù)量，增加生長卵泡數(shù)量。miR-145可通過與靶基因TGFβR2 作用，調(diào)控原始卵泡的發(fā)育，并維持原始卵泡的靜止[31]。將miR-376a轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的新生小鼠卵巢中，發(fā)現(xiàn)原始卵泡的數(shù)量增加，卵母細(xì)胞凋亡降低。卵母細(xì)胞凋亡的降低是miR-376a與靶基因PCNA(proliferating cell nuclear antigen)作用而實現(xiàn)[6-7]。在鼠胎兒期(交配后18.5 d)過表達(dá)miR-376，降低促凋亡基因(Bax、Tnf和Tnfr2)的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因(Bcl2)和卵母細(xì)胞存活基因(Pard6a，Lhx8)的表達(dá)。以上研究可知，miR-143、miR-145、miR-376a均在在卵泡發(fā)生中具有重要的作用[32]。

2.2 miRNA在卵泡發(fā)育和優(yōu)勢卵泡選擇中的作用

通過高通量測序技術(shù)，對哺乳動物從屬卵泡到優(yōu)勢卵泡過渡期(或健康卵泡和凋亡卵泡)的膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[10,30]、卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體[33]、卵泡液[34]及黃體測序[35-36]表明，miRNA在卵泡生長和優(yōu)勢卵泡選擇中起重要作用。Salilew-Wondim等[10]在牛健康大卵泡和凋亡大卵泡中發(fā)現(xiàn)523個差異miRNA分子。其中，miR-144、miR-202和miR-873在健康大卵泡中表達(dá)量高于凋亡大卵泡，推測這3個miRNA分子可能與優(yōu)勢卵泡選擇有關(guān)；miR-873表達(dá)量最高，暗示其可能在優(yōu)勢卵泡的選擇中起重要作用。 Schauer等[36]研究表明，在馬的優(yōu)勢卵泡、從屬卵泡中，miR-132、miR-212、miR-21、miR-145、miR-224和 miR-378差異表達(dá)，暗示這些miRNAs與卵泡選擇和排卵有關(guān)。Salilew-Wondim 等[10]研究表明，牛發(fā)情期3～7 d，從屬卵泡和優(yōu)勢卵泡中有244個miRNAs分子差異表達(dá)。其中,let-7家族、miR-10b、miR-26a、miR-27b和miR-99b在整個發(fā)情周期都高表達(dá)，在發(fā)情第4～7天中，從屬卵泡中miRNAs表達(dá)量幾乎沒有變化，而優(yōu)勢卵泡中miRNA表達(dá)量變化較大。通過比較馬排卵期和非排卵期卵泡液miRNA分子發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-23b、miR-378和miR-202高表達(dá)在排卵期卵泡，而miR-145則高表達(dá)在非排卵期卵泡液中[37]。通過miRNA測序和分析表明，上述miRNA可能在卵泡發(fā)育和優(yōu)勢卵泡的選擇中有重要作用，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

2.3 miRNA在顆粒細(xì)胞中的作用

2.3.1 miRNA對顆粒細(xì)胞增殖的影響 顆粒細(xì)胞的增殖和功能對于卵泡發(fā)育、成熟和凋亡有重要的作用。miRNA在促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、存活、凋亡和功能維持起重要的作用(表1，2)。Dang等[38]研究表明，miR-379-5通過互補(bǔ)結(jié)合靶基因RARP1、XRCC6，抑制顆粒細(xì)胞增殖，并降低DNA修復(fù)效率。而miRNA 17-92 cluster (miR-17-5p、miR-19a、miR-20a、miR-92a) 通過靶向結(jié)合PTEM和BMPR2基因，調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖分化[39]。Yin等[40]研究表明，在鼠體內(nèi)、外顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-320，均能抑制顆粒細(xì)胞的增殖；miR-320的表達(dá)和對顆粒細(xì)胞增殖的抑制作用能夠被miR-383進(jìn)一步促進(jìn)。多囊卵巢綜合征中過表達(dá)miR-93，能夠通過與靶基因周期依賴抑制酶(CDKN1A)作用，增加人顆粒癌細(xì)胞的增殖，高濃度的胰島素也能夠誘導(dǎo)miR-93表達(dá)，增加KGN增殖，降低CDKN1A表達(dá)[41]。

2.3.2 miRNA對顆粒細(xì)胞凋亡的影響 研究表明，miRNA對顆粒細(xì)胞有抗凋亡和促凋亡作用(表1，表2)。在抗凋亡方面，Yan等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-145能夠通過與靶向作用于激活素受體ⅠB (activin receptorⅠB,Acvr1b) 基因，抑制顆粒細(xì)胞凋亡。miR-21在抗凋亡中起作用，抑制miR-21能夠誘導(dǎo)老鼠顆粒細(xì)胞和卵巢凋亡，降低排卵率[11]; miR-21也能通過與靶基因Smad 7作用，抑制鼠由去甲腎上腺素介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡[15]。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-92a能夠通過作用Smad7抑制豬顆粒細(xì)胞凋亡，miR-182可通過與靶基因Smad7結(jié)合，抑制鼠多囊卵泡綜合征卵巢中顆粒細(xì)胞凋亡[42]。在促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡方面，人顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-23a能夠通過作用XIAP和CASP3靶基因，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[43]。miR-26b通過Smad和Mad-related protein 4，促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的凋亡[44]，miR-26b通過作用靶基因Smad4，促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞凋亡，可以直接和間接方式通過WSP9X調(diào)節(jié)Smad4泛素化[45]。Cao等[46]利用microRNA 芯片技術(shù)鑒定出let-7g在凋亡卵泡中顯著升高，并將let-7g過表達(dá)轉(zhuǎn)染豬顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)let-7g能夠極顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并通過MAP3K1信號途徑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡。miR-34c通過與靶基因FOXO3a作用，促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞凋亡，降低增殖能力[14]。而一些miRNA分子對增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)均有作用。例如，Let-7家族((let-7b/c/d/g)miRNA能夠降低與增殖和凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)[47]。在凋亡卵泡中，let-7a/b/c/i的表達(dá)量下降，而let-7g表達(dá)量上升[48]。在培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染let-7a/b/c/i或let-7g類似物時，let-7a/b/c/i表達(dá)量下降，而let-7g表達(dá)量上升[46]，以上研究表明，let-7家族在顆粒細(xì)胞增殖、存活、凋亡等方面均有作用。

2.3.3 miRNA對顆粒細(xì)胞類固醇分泌激素的影響 顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞能夠產(chǎn)生雌激素，以維持子宮的功能，調(diào)節(jié)激素的釋放，從而表現(xiàn)出繁殖行為。miRNA在類固醇生成中的作用見表1和表2。miR-378是類固醇生成的抑制因子，能夠抑制芳香酶的表達(dá)和雌激素的產(chǎn)生，抑制培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞PGR的表達(dá)[18]。miR-320作為類固醇合成的正調(diào)控因子，能夠通過E2F1和SF1兩個靶基因作用，抑制鼠雌激素合成和顆粒細(xì)胞增殖。而在卵巢中注射miR-320，能夠抑制雌激素的釋放，但卻促進(jìn)睪酮和孕酮的產(chǎn)生[41]。miR-383能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞中雌激素的產(chǎn)生，但不影響孕酮的釋放[19]。miR-34a和miR-320分別能夠抑制人顆粒細(xì)胞和鼠卵巢雌激素的釋放[40,49]；而miR-132能夠抑制NURR1(CYP19A1的負(fù)調(diào)控因子)的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，促進(jìn)雌激素的合成[50]。

2.4 miRNA在膜細(xì)胞中的作用

卵泡的發(fā)生、發(fā)育受促性腺激素LH和FSH共同調(diào)控。在哺乳動物上，顆粒細(xì)胞在FSH作用下，將雄激素轉(zhuǎn)化生成雌二醇。而膜細(xì)胞是在LH作用下合成雄激素[51]。與顆粒細(xì)胞相比，卵泡膜細(xì)胞miRNA研究則相對較少(表1，表2)。對綿羊卵泡-黃體過渡期卵泡膜miRNA測序，通過Northern雜交發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p、miR-145、miR-31、miR-125b、miR-503、miR-21在膜細(xì)胞中高表達(dá)，提示這些基因可能在膜細(xì)胞中起重要作用[52]。過表達(dá)miR-26a-5p能夠通過靶基因TNRC6A促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞增殖[53]。Robinson[54]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在牛從屬卵泡中的表達(dá)量顯著高于在優(yōu)勢卵泡中的表達(dá)量，且FGF9處理后，miR-221在膜細(xì)胞中的表達(dá)量增加，表明，miR-221可能在膜細(xì)胞中發(fā)揮作用。在卵泡中，膜細(xì)胞主要生成雄激素，并在促卵泡血管發(fā)生中具有重要作用[55]。

表1miRNA在卵泡發(fā)育中的作用

Table1RolesofmiRNAingranulosalcell,thecacell,corpusluteumandoccyte

miRNA表達(dá)定位Site of expression功能Function靶基因Target物種Species參考文獻(xiàn)ReferencemiR-221顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞降低顆粒細(xì)胞雌激素和孕酮的產(chǎn)生NDBovine[17,54]miR-379-5p顆粒細(xì)胞抑制顆粒細(xì)胞增殖,降低DNA修復(fù)效率PARP 1XRCC 6Human[38]miR-205顆粒細(xì)胞促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡,抑制雌激素釋放CREB 1Mouse[17]miR-130b顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、卵母細(xì)胞促進(jìn)顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞,卵母細(xì)胞成熟和胚泡形成SMAD 7TGFBR 2Bovine[56]miR-34c顆粒細(xì)胞促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡,降低增殖能力FOXO3aPig[14]miR-26a-5p膜細(xì)胞促進(jìn)膜細(xì)胞增殖TNRC6AChicken[53]miR-21顆粒細(xì)胞抗凋亡(體內(nèi))NDMouse[11]顆粒細(xì)胞抑制凋亡Smad 7Rat[15]miR-182顆粒細(xì)胞抑制顆粒細(xì)胞凋亡Smad 7Rat[42]miRNA 17-92 cluster (miR-17-5p, miR-19a, miR-20a,miR-92a)顆粒細(xì)胞促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖分化PTENBMPR 2Bovine[39]miR-143顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡Smad 4Pig[57]

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

ND. 不確定

ND. Not determined

3 小結(jié)和展望

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已從不同物種卵巢中篩選鑒定了大量miRNA分子。這些miRNA分子差異表達(dá)在不同類型、不同時期或不同生理條件下的卵泡細(xì)胞中。對miRNA進(jìn)行功能研究表明，miRNA在早期卵泡發(fā)生、顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及類固醇合成分泌中發(fā)揮重要作用。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，大量的miRNA差異表達(dá)在卵泡選擇過程中，但其作用的分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。在卵泡選擇過程中，卵泡組織形態(tài)學(xué)、類固醇激素合成分泌及相關(guān)的內(nèi)分泌因子等方面發(fā)生著重要的變化[65-67]。因此，要更好地理解miRNA在卵泡選擇中的作用機(jī)制，需要從不同的角度研究miRNA在卵泡中的分子機(jī)制。膜細(xì)胞在雄激素生成、卵泡血管發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，但目前關(guān)于miRNA在膜細(xì)胞中的研究報道較少，因此這也是今后研究的一個方向。

由于miRNA與靶基因間互作以及分子調(diào)控的復(fù)雜性，對miRNA功能研究變得復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性。雖然一部分miRNA單獨作用于某些特異的信號通路，但大多數(shù)miRNA成簇且精細(xì)地調(diào)控著細(xì)胞功能[32,68]。因此，如果僅對某個miRNA分子進(jìn)行功能研究，可能不會導(dǎo)致生物性狀的顯著變化。一個比較好的解決方式是通過過表達(dá)同簇miRNA分子估計miRNA的功能，以及對其他miRNA分子的影響[32]。除此之外，miRNA發(fā)揮功能還受激素和細(xì)胞周期的影響，為了更加深入地理解miRNA在卵泡發(fā)育中的作用機(jī)制，需要在不同的激素環(huán)境和生長因子作用下，探索miRNA與靶基因的整體網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。因此，利用高通量測序技術(shù)，測定不同時空條件下卵巢中miRNA表達(dá)譜，對揭示miRNA與卵泡發(fā)育的關(guān)系起重要作用。

表2miRNA在顆粒細(xì)胞中的作用

Table2RolesofmiRNAingranulosacells

功 能FunctionmiRNA參考文獻(xiàn)Reference促進(jìn)增殖Increase proliferationmiR-7, miR-9, miR-93, miR-105, miR-108, miR-128, miR-132, miR-141, miR-142, miR-152, miR-188, miR-191, miR-224, miR 17-92 cluster[39,47,41,59]降低增殖Decrease proliferationmiR-125b, miR-181a, miR-320, miR-383,miR-503, miR-379-5p[8,38,47,60]誘導(dǎo)凋亡Induce apoptosislet-7 g, miR-15a, miR-18, miR-23a, miR-26b, miR-29a, miR-32, miR-34a, miR-92, miR-96, miR-124, miR-125a, miR-136, miR-147, miR-183, miR-205, miR-34c[14,17,42-45 ]抑制凋亡Inhibit apoptosismiR-21, miR-145, miR-92a, miR-125b, miR-182[13,15,42,47,62]調(diào)節(jié)類固醇生成和類固醇相關(guān)基因Regulate steroidogenesisand steroidogenesis- related genesmiR-21, let-7 family, miR-15a, miR-16, miR-23a, miR-34a, miR-125b, miR-132, miR-145, miR-210, miR-224, miR-320, miR-378, miR-383, miR-423-5p, miR-513a-3p, miR-221, miR-93, miR-21[17-19,49-50,58,59,63-64]

另外，miRNA功能的研究主要基于模式生物。雖然對模式生物的研究能夠為人們了解miRNA在卵泡中的發(fā)育作用提供幫助，但物種間的差異也可能會造成miRNA分子功能上的差異。此外，miRNA調(diào)控也受動物生理狀態(tài)的影響。因此，對除模式動物外的物種miRNA分子進(jìn)行功能研究也非常必要?；蚓庉婥RISPR等技術(shù)為在其他物種卵巢中深入研究miRNA功能提供了可能。這也將對了解動物繁殖性狀調(diào)控的分子機(jī)制提供幫助。另外，miRNA可能在卵巢疾病臨床診斷、治療方面有較大的應(yīng)用前景。因此，在今后的研究中，利用新的生物技術(shù)對miRNA在動物體內(nèi)的生理功能研究尤為重要。