6-溴-靛玉紅-3′-肟抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡

劉 暢，唐 鑫,張文勁,趙春陽，郭愛珍,2，胡長敏,2*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070; 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

奶牛乳腺炎嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)，不僅制約養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展，由治療奶牛乳腺炎所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增加及抗生素殘留，給人類健康帶來巨大威脅。乳腺炎是乳腺的一種炎癥反應(yīng)，多由病原微生物刺激乳腺細(xì)胞所致。乳腺上皮是乳腺的天然屏障，病原微生物或其分泌的毒素可損傷乳腺上皮并且引起上皮細(xì)胞的異常凋亡，使其屏障功能喪失，造成乳腺損傷。目前，大多數(shù)研究集中于抗奶牛乳腺炎藥物的研究，但對抑制病原微生物刺激乳腺時所誘發(fā)的凋亡作用研究較少。

從青黛、大青葉等中藥提取的主要有效成分——靛玉紅(indirubin)，具有良好的生物學(xué)活性，臨床上主要用于治療腫瘤[1]。研究發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以抑制乳腺炎過程中小鼠乳腺上皮細(xì)胞(MMECs)的凋亡作用，避免乳腺細(xì)胞產(chǎn)生過度的炎癥[2]。6-溴-靛玉紅-3′-肟(6-bromo-indirubin-3′-oxime, BIO或6BIO)是靛玉紅的衍生物之一，解決了因靛玉紅具有大π共軛體系平面剛性骨架所致的水溶性差的問題。BIO能特異性抑制糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)，激活Wnt信號通路[3]。Wnt信號不僅是胚胎發(fā)育過程的關(guān)鍵部分，而且在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4]。

脂多糖(LPS)刺激Toll樣受體4(TLR4)誘導(dǎo)關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子，對免疫調(diào)節(jié)必不可少，同時對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用[5]。本研究通過LPS刺激MMECs構(gòu)建凋亡模型，BIO干預(yù)后檢測相關(guān)凋亡因子及凋亡通路的變化，旨在闡明BIO對LPS誘導(dǎo)的MMECs凋亡反應(yīng)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

妊娠15～20 d昆明鼠購自長江大學(xué)試驗(yàn)動物中心，所有操作遵循動物福利。

1.2 試劑

BIO(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；LPS、人表皮生長因子(hEGF)、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白是Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；DMEM/F12 于Hyclone公司購買；膠原酶Ⅰ、Ⅱ(Collagenase Ⅰ、Ⅱ)購自Solarbio公司；Trizol購自Life公司；BCA試劑盒購自碧云天公司；MTT試劑盒(A312-01/02)、Hiscript?II RT Super Mix for PCR(R212-01)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111-02)和Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(A211-01/02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2一抗購自英國Abcam公司；β-actin一抗購自中國博士德生物公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗購自Southern-Biotech公司；ECL發(fā)光液購自Thermo公司。15、50 mL離心管，T175細(xì)胞瓶，6、12、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自LabServ公司；40和70 μm細(xì)胞濾器產(chǎn)自FALCON公司；美國ABI熒光定量PCR儀專用96、384孔板購自Life公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

全溫震蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160)為太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)(CT15RE)為Hitachi公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HPG-280BX(HX)/400BX(HX))、超凈工作臺(DL-CJ-2NDI)為哈東聯(lián)公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(BD_FACSCalibur)購自美國BD公司；渦旋振蕩器(vortex-genie2)產(chǎn)自美國Scientific Industries公司；實(shí)時熒光定量PCR儀(VII7)產(chǎn)自美國ABI公司，化學(xué)發(fā)光儀(ImageQuant LAS 500)購自GE公司。

1.4 MMECs提取

斷頸處死妊娠15～20 d的昆明鼠后，將其全身浸泡于75%酒精中1 min，超凈臺中采集小鼠第4、5對乳腺，稱重；提前配制含2%雙抗的PBS，預(yù)冷，將所得乳腺放于提前滅菌的250 mL燒杯中，用PBS清洗干凈后將乳腺組織剪碎至糊狀，每克乳腺加入胰蛋白酶-EDTA 4 mL、膠原酶Ⅰ、Ⅱ各4 mL加入燒杯中混合均勻后轉(zhuǎn)入滅菌錐形瓶中，密封，37 ℃、110 r·min-1消化至無組織塊，將消化后的勻漿液轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管中25 ℃、250 g·min-1離心5 min。收集細(xì)胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12重懸，懸液用70 μm細(xì)胞篩過濾，收集濾液，去除未消化組織塊。收集濾液，再次離心后取沉淀，加入適當(dāng)胰蛋白酶-EDTA重懸，消化2 min，加入含10% FBS的DMEM/F12終止反應(yīng)。相同條件離心，清洗細(xì)胞，徹底終止胰酶作用，反復(fù)離心3次，用40 μm細(xì)胞篩過濾后離心取細(xì)胞沉淀，用適量細(xì)胞生長液重懸細(xì)胞，加入細(xì)胞瓶中，放于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中，1 h后將細(xì)胞懸液吸出轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，1 h后再將細(xì)胞懸液吸出加入細(xì)胞板中培養(yǎng)。

1.5 MTT試驗(yàn)

每孔104個細(xì)胞接種到96孔板，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)過夜。設(shè)置無細(xì)胞對照孔、有細(xì)胞對照組(有細(xì)胞但不加藥)、終濃度為1 μg·mL-1的LPS組，0.1%的DMSO組，5、25、50 nmol·L-1BIO處理組以及BIO(5、25、50 nmol·L-1)+LPS共刺激組，每組設(shè)置5個重復(fù)孔。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h，各孔加入10 μL MTT，4 h吸出上清，PBS小心潤洗2～3遍，各孔加入150 μL DMSO，10 min后于490 nm和570 nm波長測定各孔OD值。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力 =(加藥組細(xì)胞OD值-無細(xì)胞組OD值)/(對照組細(xì)胞OD值-無細(xì)胞組OD值)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 分組及處理

本試驗(yàn)設(shè)置空白對照組、DMSO組、BIO組、LPS組和BIO+LPS處理組。1)空白對照組：正常培養(yǎng)組；2)DMSO組：使用終濃度為0.1% DMSO刺激組(因DMSO為BIO的溶劑，為排除DMSO對MMECs存在影響的可能性，本試驗(yàn)設(shè)立DMSO組)；3)BIO組：使用濃度為50 nmol·L-1的BIO刺激細(xì)胞；4)LPS組：使用終濃度為1 μg·mL-1的LPS刺激細(xì)胞；5)BIO+LPS處理組：使用BIO濃度為5、25、50 nmol·L-1預(yù)處理細(xì)胞，1 h后使用終濃度為1 μg·mL-1的LPS刺激細(xì)胞。

所有細(xì)胞均在細(xì)胞匯合度為80% 時開始處理，處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

刺激細(xì)胞完成后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞。用不含EDTA的胰酶消化3 min，用含有10%FBS的DMEM/F12終止消化作用，收集細(xì)胞懸液后300 g 4 ℃離心5 min，PBS清洗3次后，用100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。分別加入5 μL FITC、PI染料后混勻，室溫避光靜置10 min。最后加入400 μL Binding Buffer混勻后上機(jī)檢測。

1.8 qRT-PCR

收集細(xì)胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況(引物見表1)。反應(yīng)采用10 μL體系：AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 5 μL；上下游引物各0.2 μL； cDNA 5倍稀釋后加1.5 μL；ddH2O 3.1 μL。程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。qRT-PCR的結(jié)果采用2-△△Ct法處理。

表1qRT-PCR相關(guān)引物序列表

Table1SequenceofprimersusedinqRT-PCR

基因Gene引物序列(5′→3′)Primers sequence(5′→3′)BaxF:TGCAGAGGATGATTGCTGACR:GATCAGCTCGGGCACTTTAGBakF:AGGTGACAAGTGACGGTGGTR:AAGATGCTGTTGGGTTCCAGBcl-xlF:GCTGGGACACTTTTGTGGATR:TGTCTGGTCACTTCCGACTGBcl-2F:ATGCCTTTGTGGAACTATATGGCR:GGTATGCACCCAGAGTGATGCCaspase-3F:TGTCATCTCGCTCTGGTACGR:AAATGACCCCTTCATCACCACaspase-8F:CCGAGAGGAGATGGTGAGAGR:TCGGTAGGAAACGCAGTTCTβ-actinF:TGCTGTCCCTGTATGCCTCTR:GGTCTTTACGGATGTCAACG

1.9 Western blot

收集刺激后細(xì)胞，每孔加預(yù)冷的PBS清洗 3遍；每孔加入適量預(yù)冷RIPA裂解液吹打裂解后將裂解液轉(zhuǎn)移預(yù)冷的1.5 mL EP管中，冰上裂解1 h；4 ℃，12 000 g離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中；吸取20 μL上清用BCA試劑盒測蛋白濃度(嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作)，其余上清中加入2×上樣緩沖液，沸水煮10 min。

每孔上樣20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜，BSA(5%)室溫封閉2～3 h，一抗(Caspase-3和Bcl-2以1∶2 000稀釋，Caspase-8以1∶1 000，β-actin以1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜；羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h， ECL發(fā)光檢測。

1.10 數(shù)據(jù)分析

凋亡細(xì)胞百分比用FlowJo 7.6軟件分析，Western blot灰度分析用Image J軟件分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Prism 7.0軟件進(jìn)行分析，*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 BIO對MMECs生長活性的影響

基于本實(shí)驗(yàn)室前期對BIO細(xì)胞毒性的研究(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，選擇BIO濃度為5、25、50 nmol·L-1進(jìn)行其抗凋亡作用的評價。MTT法檢測結(jié)果如圖1，結(jié)果顯示DMSO組MMECs的細(xì)胞活力略有升高，但與對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LPS組MMECs的細(xì)胞活力略有下降，但與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該結(jié)果提示DMSO與LPS對MMECs的生長無影響。單獨(dú)使用BIO刺激及使用BIO與LPS共同刺激對細(xì)胞生長并無抑制作用，各個組細(xì)胞活力均在93%以上，且各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明LPS和BIO對細(xì)胞生長無影響，后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不受細(xì)胞活性變化的影響。

CON.空白對照組；DMSO.DMSO處理組；LPS.LPS處理組，作用終濃度為1 μg·mL-1;5、25、50為BIO作用濃度，單位nmol·L-1;“5+LPS”、“25+LPS”、“50+LPS”為相應(yīng)濃度的BIO與LPS聯(lián)合使用CON.Blank control group;DMSO.DMOS treatment group;LPS.LPS treatment group,the final concentration was 1 μg·mL-1;5，25,and 50 were the concentrations of BIO (nmol·L-1);“5+LPS”,“25+LPS”, and “50+LPS” indicated the combined application of BIO (with corresponding concentration) and LPS圖1 LPS及BIO對小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of LPS and BIO on MMECs viability

2.2 BIO抑制LPS誘導(dǎo)的MMECs的凋亡

選用流式細(xì)胞術(shù)研究不同濃度BIO對MMECs凋亡作用的影響。結(jié)果如圖2所示，CON組凋亡細(xì)胞百分比為10.65%±0.41%，DMSO組凋亡細(xì)胞百分比為11.16%±0.31%，與CON組無明顯差異，表明DMSO作為BIO的溶劑，低濃度時對MMECs凋亡無影響。BIO處理組凋亡細(xì)胞百分比為11.07%±0.63%，較對照組無明顯差異，該結(jié)果提示BIO單獨(dú)作用于MMECs時對細(xì)胞的凋亡無影響。LPS組凋亡細(xì)胞百分比(20.35%±0.34%)相較于CON組(10.65%±0.41%)升高近2倍，表明LPS可促進(jìn)MMECs的凋亡，BIO+LPS組中，隨BIO濃度的增加，細(xì)胞凋亡百分比逐漸減少(19.32%±0.25%、14.93%±0.64%、10.74%±0.51%)，結(jié)果顯示BIO以劑量依賴的方式抑制LPS誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，且濃度為50 nmol·L-1時效果最好。

該結(jié)果提示BIO能夠下調(diào)LPS誘導(dǎo)的MMECs的凋亡，但BIO單獨(dú)作用時對MMECs的凋亡無影響，后續(xù)不再設(shè)置BIO單獨(dú)刺激組作為對照。

2.3 BIO下調(diào)LPS誘導(dǎo)的Bak、Bax、Caspase-3及Caspase-8 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量，上調(diào)Bcl-2、Bcl-xl mRNA相對轉(zhuǎn)錄量

為研究BIO抑制MMECs凋亡的分子機(jī)制，筆者首先檢測了Bak、Bax轉(zhuǎn)錄水平的變化。如圖3A所示，兩個對照組(空白對照組和DMSO處理組)中BakmRNA表達(dá)無差異，LPS組相較于空白對照組表達(dá)量升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；5、25、50 nmol·L-1的BIO處理組相較于LPS組BakmRNA表達(dá)水平均極顯著下降(P<0.001)，各個濃度之間無顯著差異；如圖3B所示，對照組與DMSO組中的Bax表達(dá)量一致，LPS組表達(dá)量相較于對照組極顯著升高(P<0.001)，BIO處理組的BaxmRNA相對表達(dá)量較LPS組極顯著下降(P<0.001)，隨藥物作用濃度的升高BaxmRNA表達(dá)量稍有下降，但各個BIO處理組之間無差異，表明BIO可抑制LPS誘導(dǎo)的Bak與BaxmRNA的表達(dá)。

CON.空白對照組；DMSO. DMSO處理組；BIO. BIO單獨(dú)處理組；LPS. LPS處理組；5～50為BIO預(yù)處理組，濃度分別為5、25、50 nmol·L-1；ns. P>0.05；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P <0.001CON. Blank control group; DMSO. DMSO treatment group; BIO. BIO alone treatment group; LPS. LPS treatment group, and 5-50 is BIO pretreatment group, and the concentrations are 5, 25, 50 nmol·L-1, respectively. ns. P>0.05；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P <0.001圖2 BIO對MMECs凋亡率的影響Fig.2 Effect of BIO on apoptosis rate by flow cytometry

由于Bcl-2與Bcl-xl可抑制Bak與Bax活性，因此筆者檢測了Bcl-2、Bcl-xl的轉(zhuǎn)錄情況。如圖3C所示，空白對照組、DMSO組、LPS組的Bcl-xlmRNA相對轉(zhuǎn)錄量無顯著差異，各個濃度BIO處理組對Bcl-xlmRNA相對轉(zhuǎn)錄量均具有上調(diào)作用，5 nmol·L-1即可促進(jìn)Bcl-xlmRNA轉(zhuǎn)錄量的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，25和50 nmol·L-1BIO對Bcl-xlmRNA轉(zhuǎn)錄量上調(diào)作用極顯著(P<0.01)。圖3D為Bcl-2 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量變化的結(jié)果，空白對照組和DMSO組中，Bcl-2 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量一致，LPS組Bcl-2 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量相較對照組極顯著下調(diào)(P<0.01)，處理組中隨著BIO濃度的增加Bcl-2 mRNA相對轉(zhuǎn)錄量逐漸升高，呈劑量依賴性，50 nmol·L-1組效果最好。

如圖3 E 和 F 所示，Caspase-3與Caspase-8 mRNA轉(zhuǎn)錄趨勢一致，DMSO與對照組相比mRNA相對轉(zhuǎn)錄量稍有升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LPS組的轉(zhuǎn)錄量較對照組極顯著升高(P<0.001或P<0.01)，BIO處理組的基因相對轉(zhuǎn)錄量相較LPS組均極顯著降低(P<0.001)。

2.4 BIO抑制LPS誘導(dǎo)的Caspase-3及Caspase-8蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)

為更深入地研究凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，筆者檢測了其蛋白表達(dá)。結(jié)果(圖4)顯示，Bcl-2蛋白在對照組、DMSO組中表達(dá)量極低，LPS組的蛋白表達(dá)量較對照組顯著下降(P<0.05)，表明LPS可以抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，BIO處理組中，隨濃度的增加Bcl-2蛋白的表達(dá)量也不斷增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，50 nmol·L-1BIO對Bcl-2蛋白的上調(diào)作用最顯著，與LPS組相較差異極顯著(P<0.001)。上述結(jié)果表明BIO上調(diào)小鼠乳腺上皮細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制凋亡的作用。

Caspase-3與Caspase-8蛋白表達(dá)檢測結(jié)果與其mRNA表達(dá)檢測結(jié)果一致，對照組與DMSO組相比，Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，LPS組Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達(dá)量升高，處理組相較于LPS組蛋白表達(dá)量顯著降低，50 nmol·L-1的BIO對Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)的抑制效果最顯著，并呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性。

3 討 論

治療乳腺炎的過程中，除消除不良因素對乳腺的影響、抗菌消炎、提高免疫力外，還應(yīng)保護(hù)組織完整性，加速乳腺組織恢復(fù)[6]，因此治療乳腺炎的藥物能否減少細(xì)胞的異常凋亡至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞自主進(jìn)行的程序性死亡。調(diào)控凋亡的信號通路復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)的線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和細(xì)胞外的死亡受體通路等3條主要調(diào)控通路[7]。

A～F分別為Bak、Bax、Bcl-xl、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-8轉(zhuǎn)錄水平變化；CON.空白對照組；DMSO. DMSO處理組；LPS. LPS處理組，作用終濃度為1 μg·mL-1， 5、25、50為BIO (nmol·L-1)作用濃度；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P <0.001A-F show changes in the gene levels of Bak, Bax, Bcl-xl, Bcl-2, Caspase-3, and Caspase-8, respectively; CON. Blank control group; DMSO. DMSO treatment group; LPS. LPS treatment group, the final concentration was 1 μg·mL-1, and 5, 25, and 50 were the concentrations of BIO (nmol·L-1)；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖3 BIO對凋亡相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄水平影響Fig.3 Effect of BIO on apoptosis-related protein mRNA levels

本研究表明，BIO能夠降低LPS誘導(dǎo)的MMECs凋亡。本試驗(yàn)中選用1 μg·mL-1的LPS刺激細(xì)胞構(gòu)建MMECs凋亡模型，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LPS刺激細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率(20.35%±0.34%)是空白對照組(10.65%±0.41%)的2倍，表明LPS成功誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。BIO提前孵育MMECs則可以降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且隨著BIO濃度的增加MMECs的凋亡細(xì)胞百分比呈現(xiàn)梯度下降，50 nmol·L-1的濃度對細(xì)胞凋亡作用的抑制效果最顯著，凋亡細(xì)胞百分比(10.74%±0.51%)與對照組(10.65%±0.41%)幾乎一樣。但并非所有中藥或中藥提取物都對凋亡有抑制作用，部分則有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，如溫莪術(shù)有效成分β-欖香烯加速HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)的凋亡，該作用的發(fā)揮可能依賴于下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)[8]。本研究表明BIO能夠抑制MMECs的凋亡，但對于其他細(xì)胞(如癌細(xì)胞)凋亡作用的影響尚不清楚。

A. Western blot結(jié)果；B.相應(yīng)圖片灰度分析；CON.空白對照組；DMSO. DMSO處理組；LPS. LPS處理組，作用終濃度為1 μg·mL-1， 5、25、50為BIO (nmol·L-1)作用濃度；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A. Western blot results; B. Grayscale analysis; CON. Blank control group; DMSO. DMSO treatment group; LPS. LPS treatment group, the final concentration was 1 μg·mL-1, and 5, 25, and 50 were the concentrations of BIO (nmol·L-1)；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P <0.001圖4 BIO對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of BIO on expression of apoptosis-related proteins

在大多數(shù)細(xì)胞凋亡信號釋放之后，促凋亡的Bax和Bak被激活并寡聚于線粒體外膜中，引發(fā)線粒體通透改變，釋放可溶性致凋亡因子(例如參與Caspase活化的細(xì)胞色素C)到細(xì)胞質(zhì)中[9]。由于其抗體購買困難，筆者主要進(jìn)行了相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的研究。結(jié)果顯示,LPS對Bax與BakmRNA的上調(diào)作用被BIO阻斷，各個濃度的BIO對Bax與Bak表達(dá)均表現(xiàn)出良好的抑制作用，但無濃度間差異。這表明BIO能夠抑制LPS誘導(dǎo)的Bax、Bak活化。

隨后筆者研究了Bax與Bak的調(diào)控分子Bcl-2、Bcl-xl的變化。Bcl-2家族蛋白成員含有一個或多個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，該蛋白家族由抗凋亡成員和促凋亡成員組成。發(fā)揮抑制凋亡作用的主要為Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等，主要通過抑制Bax、Bak的活化來發(fā)揮功能[10]。本結(jié)果顯示LPS能抑制Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)，相較于對照組均差異極顯著，LPS對Bcl-xl的表達(dá)無明顯影響，而BIO與處理組Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)上調(diào)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。該結(jié)果提示BIO可能在一定程度上通過上調(diào)Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)而抑制LPS誘導(dǎo)的MMECs凋亡，但BIO是否能夠通過上調(diào)Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)而下調(diào)Bax與Bak的表達(dá)仍有待驗(yàn)證。

最后檢測了Caspase-3與Caspase-8的活性變化。Caspase-3與Caspase-8是凋亡刺激信號傳遞匯聚的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，Caspase-8主要受外源信號的Fas通路調(diào)控，Caspase-8被激活后促進(jìn)下游Caspase的級聯(lián)反應(yīng)[11]。Caspase-3在凋亡通路的下游，受多種因素如細(xì)胞色素C的調(diào)控，對啟動凋亡極為重要[12]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠促進(jìn)Caspase-3與Caspase-8轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，具有良好的促凋亡作用，而BIO則能夠抑制LPS誘導(dǎo)的Caspase-3與Caspase-8的表達(dá)，且各組之間沒有明顯的劑量依賴性，該結(jié)果提示BIO能在一定程度上或至少部分抑制了Caspase-3與Caspase-8的活性，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的MMECs凋亡。

BIO具體的作用靶點(diǎn)尚不清楚，可通過siRNA干擾相應(yīng)可能的作用靶點(diǎn)或利用抗體封閉的方法找出BIO具體的作用靶點(diǎn)，這為BIO后續(xù)的研究提供了方向。

4 結(jié) 論

BIO可抑制LPS誘導(dǎo)的MMECs凋亡，該作用可能是依靠Bcl-2家族的Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-xl及Caspase家族Caspase-3和Caspase-8而實(shí)現(xiàn)的(圖5)。

LPS.脂多糖；BIO. 6-溴-靛玉紅-3′-肟； Mitochondria. 線粒體；FADD.Fas相關(guān)死亡域蛋白；Apoptosis. 凋亡LPS. Lipopolysaccharide; BIO. 6-bromo-indirubin-3′-oxime; FADD. Fas-associating protein with a novel death domain圖5 BIO抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞凋亡示意Fig.5 Schematic of BIO inhibits LPS-induced mouse mammary epithelial cell apoptosis