超聲波催陳新醋的工藝研究

張媛淵，王如福，郎繁繁，侯紅萍*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

醋，在中國作為各菜系中的酸性調(diào)味品受到廣大消費者的歡迎。以老陳醋為基質(zhì)的保健醋有降低甘油三酯、軟化血管、降血脂、調(diào)節(jié)血糖等獨特功效[1]，除此之外，食醋中含有黃酮類、多酚類、蛋白黑素等多種抗氧化活性成分，可以有效地清除氧自由基抵抗機體的氧化應(yīng)激[2]。山西老陳醋是我國四大名醋之一，已有三千多年的歷史，具有色澤黑紫、醋液清澈、氣味清香、食之綿酸、醇厚不澀等特點，它含有豐富的糖類、維生素、礦物質(zhì)和鹽等多種營養(yǎng)物質(zhì)。傳統(tǒng)的山西老陳醋經(jīng)過“夏日曬，冬撈冰”的方法進行陳釀，該方法有設(shè)備占地面積大，管理相對困難，環(huán)境不理想等缺陷。因此，食醋的人工催陳技術(shù)[3-5]受到人們的青睞。人工催陳技術(shù)主要有超聲波催陳[6-8]、超高壓技術(shù)催陳[9]、化學(xué)法[5]和生物催陳技術(shù)[10-12]等。目前常用的催陳技術(shù)是超聲波催陳技術(shù)，即當(dāng)超聲波頻率＞20 kHz時，可使介質(zhì)進入振動狀態(tài)，產(chǎn)生空化效應(yīng)促進介質(zhì)中極性分子的整齊排列及低分子化合物的聚合與縮合反應(yīng)，加速酯化、縮合、氧化還原等反應(yīng)的進行，促進締合作用，增強水、醇、醛、酯等極性分子間的親和力，有利于食醋中酯香物質(zhì)的形成[9]。超聲波頻率高，波長短，方向性好，穿透力強等特點對食醋人工催陳極為有利，采用超聲波技術(shù)催陳食醋加快酯類物質(zhì)合成，提高醋品質(zhì)，提高醋的生產(chǎn)效率具有實際的應(yīng)用價值。劉鳳葉[13]采用超聲波生物生長促進儀對鎮(zhèn)江香醋進行催陳，處理后的香醋中氨基酸、乙酸和醇類物質(zhì)含量減少，減弱食醋的刺激性氣味，達到食醋陳釀的效果；王振斌等[8]采用超聲波對食醋進行催陳，對主成分分析表明催陳醋的指標與自然陳釀4年的香醋相近。

本研究以總酯含量為響應(yīng)指標，采用響應(yīng)面法對超聲波催陳新醋的工藝進行了研究，并采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用對新醋與超聲波處理后的醋中的揮發(fā)性成分進行測定、對比和分析[14-16]，在此基礎(chǔ)上與自然陳釀5個月食醋的理化指標進行了對比，以建立最優(yōu)的催陳方法，為食醋生產(chǎn)企業(yè)縮短陳釀時間，增加生產(chǎn)效益提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新釀制食醋：山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

無水乙醇、NaOH（均為分析純）、甲醛溶液（37%～40%）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；領(lǐng)苯二甲酸氫鉀、Na2CO3、氯化鉀（均為分析純）、硫酸（純度98%）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；CuSO4（分析純）：北京中聯(lián)化工試劑廠；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸氫二鉀（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；葡萄糖（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST3100實驗室pH計：奧豪斯儀器有限公司；B11-3恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；JJ124BC型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；50/30μm二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）/碳分子篩（carboxen，CAR）/聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取纖維頭：美國SUPELCO公司；TraceISO氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波催陳新醋工藝優(yōu)化單因素試驗

超聲波處理時間對食醋總酯含量的影響：將100 mL新醋置于150 mL錐形瓶中，固定頻率為40 kHz，添加0.5%（V/V）的無水乙醇，密閉放入超聲波清洗機的水槽中央，超聲波功率為180 W，溫度為47℃，處理時間分別為40 min、70 min、100 min、130 min、160 min、190 min和220 min。超聲波處理完成后，用流動水快速冷卻至常溫，分別測定食醋中總酯的含量。

在此基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法，依次考察乙醇添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、超聲波功率（80W、100W、120W、140 W、160 W、180 W、200 W）和超聲波處理溫度（27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃、57℃）對食醋中總酯含量的影響。

1.3.2 超聲波催陳新醋工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為使超聲波發(fā)揮最大且穩(wěn)定的效能，固定超聲波的功率為180 W。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計（centralcomposite design，CCD）原理，以超聲波處理時間（X1）、乙醇添加量（X2）、超聲波處理溫度（X3）為影響因素，食醋中總酯含量（Y）為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3 測定方法

理化指標主要包括總酸、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸、還原糖和總酯。總酸含量參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》的方法進行測定；氨基酸態(tài)氮含量參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》的方法進行測定；不揮發(fā)酸含量參照GB/T 18187—2000《釀造食醋》的方法進行測定；還原糖和總酯含量參照GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋》的方法進行測定。

色度[17]：以蒸餾水為對照，采用分光光度計在波長520nm處測定吸光度值，用OD520nm值表示。

感官特性：選擇3名有經(jīng)驗人員對醋的氣味與顏色進行評價。氣味分為刺鼻性、溫和性、酯味清淡和酯味濃郁；顏色分為褐色和深褐色。

1.3.4 食醋中香氣成分的分析

固相微萃?。喝? mL醋樣置于15 mL帶硅膠墊的頂空樣品瓶中，加入質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的氯化鈉完全混勻，用硅膠墊的瓶蓋密封頂空樣品瓶。采用熊越等[18]方法并加以改進：放入恒溫孵化箱，于40℃條件下保持20 min，SPME萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭，且距離液面保持1 cm的距離。在萃取溫度為40℃條件下萃取10 min。萃取頭插入GC-MS汽化室，在250℃條件下解吸5 min，啟動儀器收集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件：TG-5MS彈性毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度 250℃，載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流進樣，升溫程序：柱溫起始溫度35℃保持5 min；以5℃/min上升至160℃，保持3 min；然后以10℃/min的速度上升至250℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250℃，離子源溫度230℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為45～500 u。對照NIST/EPA/NIH 2.0版本質(zhì)譜庫鑒定得到的成分，用峰面積歸一化法進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波催陳新醋工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 超聲波處理時間對食醋中總酯含量的影響

超聲波處理時間對食醋中總酯含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲處理時間對食醋中總酯含量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on the total ester content in vinegar

由圖1可知，隨著超聲處理時間的增加，食醋中總酯含量呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)超聲波處理時間達到130 min時，食醋中的總酯含量達到最大，為12.79 g/L。分析原因可能是超聲波處理食醋時，產(chǎn)生的超聲波能量使食醋中的醇類物質(zhì)與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)，處理時間太久則可使得酯類物質(zhì)易揮發(fā)或發(fā)生水解反應(yīng)，造成酯類物質(zhì)減少。因此，超聲波處理的最佳時間為130 min。

2.1.2 乙醇添加量對食醋中總酯含量的影響

酯類物質(zhì)的提升對食醋品質(zhì)口感有很大影響，為了促進食醋中的酯化反應(yīng)，在食醋中添加適量的無水乙醇可與食醋中的有機酸反應(yīng)生成酯類物質(zhì)。乙醇添加量對食醋中總酯含量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇添加量對食醋中總酯含量的影響Fig.2 Effect of ethanol addition on the total ester content in vinegar

由圖2可知，乙醇添加量為0.2%～0.6%時，食醋中總酯含量增加的相對較快（P＜0.05），由10.94 g/L增加至13.31 g/L。隨著乙醇添加量的增加，食醋中的酯類物質(zhì)明顯增多；當(dāng)乙醇添加量＞0.6%之后，食醋中的總酯含量趨于平穩(wěn)并不再增加，達到13.33 g/L。因此，乙醇最佳添加量為0.6%。

2.1.3 超聲波功率對食醋中總酯含量的影響

超聲波功率對食醋中總酯含量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲波功率對食醋中總酯含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the total ester content in vinegar

由圖3可知，隨著超聲波功率在80～200 W范圍內(nèi)的增大，食醋中的總酯含量不斷上升并趨于平穩(wěn)，當(dāng)功率達到180 W時，食醋中的總酯含量達到最大值，為12.88 g/L，說明超聲波功率在一定范圍內(nèi)可以促進食醋的酯化反應(yīng)。因此，超聲波處理的最佳功率為180 W。

2.1.4 超聲波處理溫度對食醋中總酯含量的影響

超聲波處理溫度對食醋中總酯含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲波處理溫度對食醋中總酯含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment temperature on the total ester content in vinegar

由圖4可知，處理溫度為27～42℃時，食醋中的總酯含量呈上升趨勢；當(dāng)處理溫度為42℃時，食醋中總酯含量達到最高，為12.34 g/L；當(dāng)處理溫度＞42℃之后，食醋中總酯含量明顯下降，分析原因可能是由于處理溫度過高造成酯類物質(zhì)的揮發(fā)或者水解，使得食醋品質(zhì)下降。因此，超聲波最佳處理溫度為42℃。

2.2 超聲波催陳新醋工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果得出，超聲波催陳新醋的總酯含量（Y）與超聲波處理時間（X1）、乙醇添加量（X2）、超聲波處理溫度（X3）3因素的多元線性回歸模型方程為Y=13.71+0.19X1+0.16X2-0.099X3-0.040X1X2-0.10X1X3+0.005X2X3-0.82X12-

由表3可知，模型的P＜0.000 1，模型極顯著，表明試驗設(shè)計可靠；失擬項P=0.076 0＞0.05，影響不顯著，表明回歸方程擬合度較好，可反映3個因素與響應(yīng)值間的真實關(guān)系；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.9931，表明響應(yīng)值的變化有99.31%來源于所選因素的變化，該模型可以用于預(yù)測超聲波催陳新醋工藝的優(yōu)化程度?；貧w方差及各項方差結(jié)果表明，3個因素對食醋中總酯含量的影響主次順序為X1＞X2＞X3，即超聲波處理時間＞乙醇添加量＞超聲波處理溫度。另外，一次項X1、X2和X3對Y影響極顯著（P＜0.01），且X1和X2一次項系數(shù)為正，均為正效應(yīng)；交互項X1X3對Y影響顯著（P＜0.05）、X1X2和X2X3對Y影響不顯著（P＞0.05）；二次項對Y影響極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，各因素對食醋中總酯含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

由Design Expert 8.0.6.1得出超聲波催陳新醋理論最優(yōu)工藝條件：超聲波處理時間為137.37 min，乙醇添加量為0.63%、超聲波處理溫度為40.02℃，其預(yù)測的總酯含量為13.75g/L。為了便于實際操作，將最優(yōu)工藝條件修訂為：超聲波處理時間137min、乙醇添加量0.65%、超聲波處理溫度40℃。

2.2.2 超聲波催陳新醋工藝的響應(yīng)面分析及等高線

超聲波處理時間、乙醇添加量、超聲波處理溫度交互作用對食醋中總酯含量影響的響應(yīng)面曲線及等高線見圖5。

圖5 超聲波處理時間、乙醇添加量及超聲波處理溫度交互作用對食醋中總酯含量影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic treatment time,ethanol addition and ultrasonic treatment temperature on the total ester content in vinegar

由圖5可知，任何2個交互作用的響應(yīng)面都存在最高點，可直觀得到各因素的最優(yōu)水平及其相互作用。且X1X3的交互作用對總酯含量的影響相對于X1X2和X2X3較顯著。

2.2.3 驗證試驗

為驗證上述結(jié)果的可靠性，在此最優(yōu)條件下對新醋進行超聲波處理，做3次平行試驗，得到的食醋中實際總酯含量為（13.745 6±0.048）g/L，與預(yù)測值（13.75 g/L）一致，故得到的模型能夠較好預(yù)測實際超聲波處理食醋的條件及總酯含量，具有可靠的現(xiàn)實意義。

2.3 超聲波催陳新醋對食醋理化指標及感官特性的影響

超聲波催陳后的新醋與未處理的新醋理化指標及某些感官的比較結(jié)果見表4。

表4 超聲波催陳前后新醋理化指標及感官特性的比較Table 4 Comparison of physicochemical indexes and sensory characteristics of original vinegar before and after accelerated aging by ultrasonic g/100 mL

由表4可知，較新釀制食醋，經(jīng)超聲波處理的食醋，其總酯含量（1.38 g/100 mL）提高50%，相當(dāng)于新醋經(jīng)5個月自然陳釀后的總酯含量（1.29 g/100 mL）；總酸含量（3.98 g/100 mL）減少；氨基酸含量（0.19 g/100 mL）及還原糖含量（0.35 g/100 mL）均顯著降低（P＜0.05），因其在陳釀或人工催陳過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，加深醋的色澤，故而有所減少。從口感品質(zhì)方面來講，新釀制食醋醋味刺鼻，酯香味清淡，而經(jīng)超聲處理的食醋或經(jīng)自然陳釀的食醋，其口感良好，醋香溫和不刺鼻，酯香味較濃郁。

2.4 食醋中揮發(fā)性香氣成分的測定結(jié)果

采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用的方法從新醋與超聲波催陳新醋中共檢測出100種物質(zhì)，按照所需揮發(fā)性成分，刪減掉未知與其他相對含量極少的化合物，從中篩選出46種香氣成分，結(jié)果見表5。

由表5可知，揮發(fā)性香氣成分的種類有酸類、醇類、酯類、酚類、醛類、呋喃、吡嗪等特征性香氣成分，新醋與超聲波催陳新醋的酸、醇、酯、酚、醛和其他特征香氣的相對含量依次為15.66%和11.77%、12.11%和11.84%、8.5%和9.34%、1.4%和1.64%、18.07%和16.52%、1.93%和1.81%；自然陳釀5個月食醋的酸、醇、酯、酚、醛和其他特征香氣的相對含量（13.75%、11.68%、9.19%、1.44%、16.28%和1.96%）與超聲波催陳新醋大致相當(dāng)。

表5 食醋中揮發(fā)性香氣成分檢測結(jié)果Table 5 Determination results of volatile aroma components in vinegar

續(xù)表

經(jīng)超聲波催陳新醋后食醋中酸類與醇類物質(zhì)（不含添加的無水乙醇）的相對含量明顯減少，而酯類的相對含量增加，是因為酸類與醇類物質(zhì)發(fā)生了酯化反應(yīng)，其中乙酸、異戊酸、2-甲基丁酸、α-酮戊二酸的相對含量分別減少了32.97%、14.29%、13.79%、13.79%。醇類中1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、2-呋喃甲醇、苯乙醇的相對含量分別減少了18.39%、7.22%、13.79%、2.57%。酸類物質(zhì)的減少對改善食醋風(fēng)味有一定作用。酯類中乙酸乙酯、甲氧基乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯的相對含量增加了49.65%、1.26%、3.92%、28%、4.67%。各酯類物質(zhì)的增加提高了食醋的特征香氣，與其他香氣成分共同協(xié)調(diào)，對維持食醋特的風(fēng)味有很大作用[18]，香氣物質(zhì)的種類與含量的差異決定了不同食醋的特殊風(fēng)味。除此之外，2,3,5,6-四甲基吡嗪的相對含量也增加了5.38%，四甲基吡嗪類化合物具有甜的巧克力、可可、咖啡的香氣，對食醋的特征風(fēng)味有重要影響[19]。

3 結(jié)論

采用超聲波催陳技術(shù)對新醋進行催陳，以食醋中總酯含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到超聲波催陳新醋的最優(yōu)工藝條件：超聲波處理時間為137 min、乙醇添加量為0.65%、超聲波處理溫度為40℃、超聲波功率為180 W。在最優(yōu)工藝條件下，食醋中總酯含量達到13.75 g/L，比未處理食醋的總酯含量提高了50%，與自然陳釀5個月左右食醋的總酯含量相近；較未處理食醋，總酸、氨基酸態(tài)氮及還原糖含量均降低，其色澤棕紅、口感良好、醋香溫和不刺鼻，酯香味較濃郁，為改善傳統(tǒng)食醋的陳釀方法提供了理論依據(jù)。

采用HS-SPME和GC-MS聯(lián)用的方法從新醋與超聲波催陳新醋后的食醋中共篩選得出46種主要成分，包括酸（9種）、醇（8種）、酯（11種）、醛（7種）、酚（5種）及其他（6種）。新醋經(jīng)超聲波催陳后，總酸的相對含量減少了24.84%，酯類物質(zhì)相對含量增加了9.88%，2,3,5,6-四甲基吡嗪的相對含量也增加了5.38%。