三孢布拉霉中類胡蘿卜素增產(chǎn)方法的研究進(jìn)展

陳玉龍，王 強(qiáng)，楊清香*，付金菊

（河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，具有減少細(xì)胞損傷、減緩衰老等生理功能。目前，已經(jīng)從自然資源中分離出來(lái)600多種類胡蘿卜素，僅有50多種是對(duì)人類有益，其中被商業(yè)開發(fā)和利用的只占極少數(shù)。

圖1 不同生產(chǎn)方法所得β-類胡蘿卜素的產(chǎn)量Fig.1 Production of β-carotenoids by different production methods

類胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有三種：天然提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵。各種方法的產(chǎn)量見圖1[1]。天然提取的原料來(lái)源于花卉、植物葉子、鳥類羽毛、水果、甲殼動(dòng)物殼和魚肉等，胡蘿卜的類胡蘿卜素含量高，是目前主流的提取原料。天然提取類法可分為沉淀法萃取、冷凍干燥法提取、天然油脂懸浮液的直接制取法等，其中冷凍干燥提取法已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[2]。天然提取法生產(chǎn)類胡蘿卜素成本高，約50kg胡蘿卜才能得到2g左右的類胡蘿卜素的結(jié)晶體，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，在市場(chǎng)上很難占據(jù)一席之地。自從1953年首創(chuàng)化學(xué)合成類胡蘿卜素以來(lái)，化學(xué)合成的類胡蘿卜素由于工藝簡(jiǎn)單、快速、成本低等優(yōu)勢(shì)占據(jù)了大部分的市場(chǎng)。2015年合成資源在整個(gè)行業(yè)的價(jià)值達(dá)到9.036億美元[1]。Roche和BASF兩家公司共同壟斷著類胡蘿卜素合成資源的市場(chǎng)。Roche公司以β-紫羅酮為原料，通過(guò)C19+C2+C19Grignard反應(yīng)合成β-胡蘿卜素，BASF公司同樣以β-紫羅酮為原料，經(jīng)乙烯基β-紫羅蘭醇（Ⅳ），以C15+C10+C15方式再通過(guò)Witing反應(yīng)合成β-胡蘿卜素。雖然化學(xué)合成類胡蘿卜素的產(chǎn)量高，但是其合成的β-胡蘿卜素100%為全反式，與天然的β-胡蘿卜素相比抗遺傳毒性弱，長(zhǎng)期服用對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。相比較前兩種生產(chǎn)方法而言，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的天然類胡蘿卜素更為經(jīng)濟(jì)、安全，目前發(fā)現(xiàn)自然界中許多微生物都具有產(chǎn)生類胡蘿卜素的能力，如杜氏藻（Dunaliella）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）、三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）和卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides）等，其中三孢布拉霉類胡蘿卜素產(chǎn)量大，且不產(chǎn)生有毒有害的副產(chǎn)物，是運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要微生物，目前生產(chǎn)廠家有DSM和Vitaene公司，三孢布拉霉發(fā)酵所得的類胡蘿卜素已獲得歐盟、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局等的批準(zhǔn)。

三孢布拉霉中類胡蘿卜素的生物合成途徑是甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA pathway）。首先乙酰輔酶A（acetyl-coenzymeA，acetyl-CoA）生成類胡蘿卜素的基本骨架，即異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），然后IPP在一系列酶的催化作用下形成牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP），GGPP在八氫番茄紅素合成酶（carRA編碼）作用下形成八氫番茄紅素，再經(jīng)過(guò)八氫番茄紅素脫氫酶（carB編碼）作用生成番茄紅素，經(jīng)過(guò)番茄紅素環(huán)化酶（carRA編碼）作用最終生成γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素（見圖2）。

圖2 三孢布拉霉中類胡蘿卜素代謝途徑及關(guān)鍵基因Fig.2 Metabolic pathways and key genes of carotenoid in Blakeslea trispora

三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，但是產(chǎn)量較低，在三孢布拉霉的研究方面，提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量一直是研究重點(diǎn)。目前的研究主要分為兩個(gè)方面，其一針對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的提升，其二是針對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的提升。本文將從菌種的選育、外源添加物、工藝優(yōu)化三個(gè)方面介紹現(xiàn)階段提高三孢布拉霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的手段和方法，對(duì)不同的手段和方法的優(yōu)點(diǎn)以及不足進(jìn)行比較，期望能夠?yàn)槿卟祭构I(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素提供參考。

1 優(yōu)良菌株的選育方法

1.1 誘變育種

1.1.1 傳統(tǒng)理化誘變法

傳統(tǒng)理化誘變包括輻射誘變和化學(xué)誘變。輻射誘變通過(guò)射線（紫外線、χ射線、γ射線等）對(duì)生物材料進(jìn)行輻射，誘發(fā)其染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，從而得到突變體?；瘜W(xué)誘變通過(guò)化學(xué)誘變劑（堿基類似物、烷化劑、移碼誘變劑等）處理生物材料，引起其基因突變、染色體斷裂，產(chǎn)生突變體。傳統(tǒng)的誘變方法操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備。但具有盲目性和隨機(jī)性，育種的篩選難度大。在三孢布拉霉育種工作中，化學(xué)誘變法報(bào)導(dǎo)較多的是使用烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone，EMS）等進(jìn)行誘變，NTG、EMS具有1個(gè)或多個(gè)活性烷基，易取代脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子中活潑的氫原子，使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變，突變株類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提升。MEHTA B J等[3]利用NTG處理孢子懸液后進(jìn)培養(yǎng)，挑選具有顯著顏色差異的菌落并反復(fù)純化，所獲得的突變菌株β-胡蘿卜素的產(chǎn)量較野生型提高了近130倍，含量達(dá)到39 mg/g。相比較化學(xué)誘變而言，輻射誘變所得到的突變體不穩(wěn)定，且多為隱性突變。因此，輻射誘變往往和化學(xué)誘變相結(jié)合用于三孢布拉霉的菌種選育，在COSTA PEREZ J等[4]的專利中以紫外線、NTG、EMS分別對(duì) B.trispora（+）和B.trispora（-）進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得的突變株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后得到的β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到6.0～8.7 g/L。MARCOS RODRIGUEZ A T等[5]在專利中提到，利用紫外線、NTG和EMS分別對(duì)B.trispora（+）和B.trispora（-）進(jìn)行復(fù)合誘變，獲取的突變株經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)得到的番茄紅素產(chǎn)量高達(dá)3.7g/L。三孢布拉霉在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)均為單細(xì)胞多核體，在誘變過(guò)程中多核體的存在對(duì)突變株的分離造成了相當(dāng)大的技術(shù)難度。為解決三孢布拉霉孢子多核體難以分離的問(wèn)題，處理過(guò)后的孢子存活率一般控制在1%～5%。王強(qiáng)[6]對(duì)NTG誘變進(jìn)優(yōu)化，以質(zhì)量濃度0.5 mg/L的NTG處理三孢布拉霉的孢子懸液40～50 min時(shí)效果最佳，孢子的存活率為1%～5%，正向突變率為10%。

1.1.2 N+離子注入誘變法

離子注入誘變技術(shù)是離子經(jīng)過(guò)加速后以較高的速度射向生物材料，與靶生物中分子、原子進(jìn)行一系列的碰撞，當(dāng)入射離子能量較高時(shí)，它與靶原子分子的作用主要是非彈性碰撞過(guò)程（電子阻止過(guò)程），使生物分子電離或激發(fā)，導(dǎo)致電離損傷。入射離子能量逐漸降低后，彈性碰撞將起主要作用（核阻止過(guò)程），通過(guò)碰撞、級(jí)聯(lián)和反沖，導(dǎo)致幾百個(gè)原子移位，留下空位和斷鍵。隨著入射離子能量進(jìn)一步降低，核阻止本領(lǐng)急劇上升，能量損失達(dá)到峰值。慢化的原初離子也將以高斯分布的形式沉積下來(lái)。如果注入的是活性離子，則它們?cè)诔练e過(guò)程中將不斷地與生物分子鍵合、置換或者填充空位，形成新的分子基團(tuán)。伴隨著入射離子能量的沉積，其中小部分能量將隨著動(dòng)量方向指向表面而達(dá)到表面，引起生物體表面的二次粒子發(fā)射，即濺射。離子束對(duì)生物體的作用是集動(dòng)量傳遞、能量及質(zhì)量沉積、電荷中和與交換于一體的聯(lián)合作用，直接或間接作用誘發(fā)遺傳物質(zhì)發(fā)生突變。具有對(duì)生物體生理?yè)p傷小、突變譜廣、突變頻率高，并有一定的重復(fù)性和方向性的新特點(diǎn)[7]。使用N+離子注入三孢布拉霉菌株中，引起了生物體內(nèi)復(fù)雜的作用機(jī)制，突變頻率和篩選效率與植入的離子的能量和劑量密切相關(guān)，呈現(xiàn)出N+離子注入特有的注量-存活率曲線，即“馬鞍型”曲線等。陳恒雷等[8]以12×1015N+/cm2劑量的注入量時(shí)獲得最大的正向突變率，β-胡蘿卜素產(chǎn)量較對(duì)照高出25%，達(dá)到1.25 g/L。

1.1.3 常壓室溫等離子體誘變法

常壓室溫等離子體（atmosphericroomtemperatureplasma，ARTP）誘變技術(shù)采用粒子包括處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。等離子體射流中的活性粒子能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化，形成突變體。ARTP誘變技術(shù)是一種新興的誘變方法，相比傳統(tǒng)的物化誘變而言，其安全性更高，操作簡(jiǎn)便，對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制更為多樣，所獲得的突變類型也很多樣[9]。WANG Q等[10]利用ARTP誘變出高產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉菌株，ARTP處理150 s具有較高的篩選效率，導(dǎo)致8%的存活率和14%以上的陽(yáng)性突變率，所得到的突變株番茄紅素產(chǎn)量提升55%，達(dá)到26.4 mg/g。值得提出的是誘變出的突變株對(duì)溶解氧的需求減小，呼吸作用降低。這意味著突變株相比于原始菌株而言，更加適應(yīng)在體積較大發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)。

目前通過(guò)誘變所獲得的高產(chǎn)菌株相比于野生菌株在類胡蘿卜素的產(chǎn)量上已經(jīng)有了很大的提升，但是其產(chǎn)量很難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。單一的誘變因素往往無(wú)法獲得較為理想的效果，多種因素相結(jié)合的復(fù)合誘變往往成了較好的選擇。以傳統(tǒng)的理化誘變與新興的N+離子注入和ARTP誘變等組成復(fù)合誘變，對(duì)內(nèi)在大分子作用的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞壁細(xì)胞膜也造成損傷。復(fù)合誘變因誘變機(jī)制不同，可獲得的突變形式也很多樣，通過(guò)篩選獲得期望菌株的概率也相對(duì)增大。WANG Q等[11]用NTG和N+離子注入誘變分別對(duì)B.trispora（+）和B.trispora（-）進(jìn)行復(fù)合誘變，經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵后番茄紅素產(chǎn)量提高64%，達(dá)到28.8 mg/g。

1.2 基因工程育種

近年來(lái)三孢布拉霉中有關(guān)類胡蘿卜素合成的基因已經(jīng)相繼被報(bào)道，合成類胡蘿卜素的相關(guān)基因被克隆到一些生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)需求低的微生物中，如大腸桿菌和畢氏酵母[12]，期望能降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。但到目前為止，這些工程菌中類胡蘿卜素的產(chǎn)量仍然很低，難以運(yùn)用到工業(yè)化生產(chǎn)。WANG Y等[13]對(duì)三孢布拉霉自身基因組進(jìn)行改造，利用同源重組基因打靶技術(shù)編輯carRA基因，敲除其中的carR序列（番茄紅素環(huán)化酶編碼序列），阻止番茄紅素進(jìn)一步合成β-胡蘿卜素，提高番茄紅素產(chǎn)量。但所獲得的carR缺陷型菌株的番茄紅素產(chǎn)量只有少量提升。值得關(guān)注的是其意外獲得了幾株carA雙拷貝菌株，搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中加入番茄紅素環(huán)化酶抑制劑，最終所得到的番茄紅素產(chǎn)量高達(dá)103.58 mg/g。這意味著在今后的工作中可以通過(guò)增多carA拷貝數(shù)來(lái)獲取高產(chǎn)類胡蘿卜素的工程菌。鞏尊洋等[14]率先克隆到了三孢布拉霉中的負(fù)調(diào)控基因crgA，并對(duì)其進(jìn)行了敲除，在發(fā)酵前36 h番茄紅素迅速積累，隨后緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素，且類胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高。然而，在敲除crgA的菌株中均無(wú)接合孢子的生成。

三孢布拉霉合成過(guò)程中涉及到的基因復(fù)雜，許多功能基因還未被發(fā)現(xiàn)，代謝調(diào)控機(jī)制還未完全被闡明，而且雙功能基因carRA同時(shí)編碼八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶，一直是研究的難點(diǎn)。期望近年來(lái)基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和三代測(cè)序技術(shù)的成熟，對(duì)于三孢布拉霉新的功能基因的發(fā)現(xiàn)及育種工作有積極的影響。

2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1 高產(chǎn)類胡蘿卜素培養(yǎng)基的優(yōu)化

培養(yǎng)環(huán)境中碳氮比對(duì)類胡蘿卜素的合成具有很大的影響，不同碳氮比的培養(yǎng)環(huán)境，不僅影響著發(fā)酵所得到的類胡蘿卜素的總量，而且對(duì)其中的β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、番茄紅素的百分含量也有較大的影響[15-16]，碳源充足氮源缺乏更有利于類胡蘿卜素的產(chǎn)成[17]。三孢布拉霉的生長(zhǎng)分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是菌體的增長(zhǎng)，第二個(gè)階段是菌體中類胡蘿卜素的積累。在菌絲體增長(zhǎng)階段提供充足的碳源和氮源，利于菌絲體生長(zhǎng)，提高生物量。在類胡蘿卜素合成階段則要提供碳源充足、氮源缺乏的培養(yǎng)環(huán)境，利于類胡蘿卜素在菌絲體中的積累。因此，培養(yǎng)基優(yōu)化要把握好菌體生長(zhǎng)環(huán)境中碳源和氮源的比例，在生長(zhǎng)的第二階段適當(dāng)?shù)倪x擇補(bǔ)充碳源提高類胡蘿卜素的積累。CHOUDHARIS等[17]對(duì)不同的碳源、氮源、硫酸鹽、pH進(jìn)行了摸索，并用響應(yīng)面優(yōu)化法確定最適添加量，發(fā)現(xiàn)在以葡萄糖、L-天冬氨酸、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4為基質(zhì)的培養(yǎng)基中發(fā)酵所得的β-胡蘿卜素產(chǎn)量較高（0.14 mg/mL）。除了培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分問(wèn)題，三孢布拉霉在液體培養(yǎng)基中菌絲體抱團(tuán)成球，不利于正、負(fù)菌絲體之間的物質(zhì)交換，影響產(chǎn)量的提升。為了解決菌絲抱團(tuán)問(wèn)題，BOHME K等[18]在培養(yǎng)基中加入0.2%的瓊脂使菌體明顯分散，SCHAAP A等[19]在專利中以玉米干粉，麥芽糖等作為基底能夠獲得較高的番茄紅素產(chǎn)量（0.3 mg/mL），防止菌絲體抱團(tuán)成球。目前在工業(yè)化的生產(chǎn)中多用到的是玉米粉等作為培養(yǎng)基底。此外，在發(fā)酵過(guò)程中人為的少量的添加某些外源物質(zhì)可以刺激類胡蘿卜素的產(chǎn)量提升，關(guān)于這類物質(zhì)的報(bào)道有很多，這里主要介紹幾種對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量提升有明顯刺激的，并解釋某些外源物可能的作用機(jī)制。

2.1.1 加入三孢酸結(jié)構(gòu)類似物

三孢酸（trisporic acid）是三孢布拉霉在正菌和負(fù)菌協(xié)同作用下將β-胡蘿卜裂解并轉(zhuǎn)化形成的，可以刺激三孢布拉霉大量合成類胡蘿卜素，因而稱之為性激素。三孢酸結(jié)構(gòu)類似物在結(jié)構(gòu)上與三孢酸相似，在研究中發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)也能刺激三孢布拉霉提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，三孢酸結(jié)構(gòu)類似物有α-紫羅酮、β-紫羅酮、脫落酸、維生素A等，其中以脫落酸的作用效果最好。徐君偉等[20]向培養(yǎng)基中添加9.36nmol/L脫落酸時(shí)所獲得的番茄紅素產(chǎn)量最高（0.54g/L），相對(duì)于對(duì)照提高出44%。三孢酸結(jié)構(gòu)類似物能夠刺激類胡蘿卜素產(chǎn)量提升的原因可能是其起到了類似于三孢酸的作用，也可能是為類胡蘿卜素的合成提供碳骨架。

2.1.2 加入菌體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物

氧化應(yīng)激是指生物體促氧化-抗氧化平衡機(jī)制受到干擾，機(jī)體氧化與抗氧化作用失衡，多傾向于氧化。機(jī)體為了維持促氧化-抗氧化機(jī)制的平衡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，形成了兩種應(yīng)對(duì)系統(tǒng)，即酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)。酶抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等，非酶系統(tǒng)主要有谷胱甘肽、抗壞血酸、生育酚、類胡蘿卜素等。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中存在氧載體、氧化物等，引起三孢布拉霉氧化應(yīng)激效應(yīng)，菌體細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶（SOD、CAT）活性會(huì)明顯增高，而類胡蘿卜素是一種有效的抗氧化物，作為非酶抗氧化系統(tǒng)對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，應(yīng)對(duì)氧化壓力，防止細(xì)胞自我分解具有積極的作用[21]，其合成量也會(huì)明顯上升。二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）原本是一種抗氧化劑在食品加工中較為多見，用于防止食品腐敗。SMIRNOVA E G等[22]研究表明，添加BHT后并沒有抑制超氧化物的形成，相反的是BHT作為一種助氧化劑直接和氧分子作用形成超氧陰離子，促進(jìn)了超氧化物的產(chǎn)生，引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。在培養(yǎng)基中添加20 mmol/L的BHT所獲得的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量較對(duì)照提高了5倍，達(dá)125 mg/g，而且添加BHT后菌絲體由大面積的聚集而變得分散，更有利于正負(fù)菌之間的物質(zhì)傳遞（如三孢酸）。此外，氧載體如正己烷、正十二烷、過(guò)氧化氫都可以增加體系的溶解氧，一定程度的引起菌體的氧化應(yīng)激，提高類胡蘿卜素產(chǎn)量。但并不是所有的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物都能提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，如NANOU K等[23]外源添加5.0 mmol/L的氯化鐵引起三孢布拉霉強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性增加，類胡蘿卜素總的合成量并沒有顯著的增加，只是類胡蘿卜素的組成成分發(fā)生了較大的變化，其中β-胡蘿卜素含量顯著降低。

2.1.3 加入外源油脂

培養(yǎng)基中存在的外源植物油可以被菌體吸收利用，轉(zhuǎn)化為自身的脂肪酸，因此三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)不需要再提供大量的乙酰-CoA用于菌體脂肪酸合成，使更多的乙酰輔酶A能夠通過(guò)甲羥戊酸途徑合成類胡蘿卜素。此外，菌體吸收的脂肪酸一方面可以增加脂溶性類胡蘿卜素在細(xì)胞內(nèi)的溶解度，另一方也可以分解成乙酰-CoA提供細(xì)胞生長(zhǎng)或類胡蘿卜素的合成，也有報(bào)道稱[24]三孢酸、β-紫羅酮等只有在外源植物油存在的情況下才發(fā)揮其作用，所以添加外源植物油不僅對(duì)三孢布拉霉中類胡蘿卜的合成有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而且有利于菌絲體的生長(zhǎng)。MANTZOURIDOU F等[25]添加粗大豆油到葡萄糖培養(yǎng)基，所得β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高40多倍，VERESCHAGINAOA等[26]對(duì)不同植物油中的組分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)富含亞麻酸的外源植物油，如亞麻籽油、棉籽油、葵花籽油等對(duì)類胡蘿卜素合成的刺激作用更加明顯。

近期報(bào)導(dǎo)的以工業(yè)甘油，食用廢油作為三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的原料，其產(chǎn)量可相當(dāng)可觀[27-29]。肥皂制造業(yè)中造化反應(yīng)反生的副產(chǎn)品-工業(yè)甘油和日常生活的食用廢油，它們用作為三孢布拉霉的發(fā)酵的培養(yǎng)基，相比高成本的培養(yǎng)基廉價(jià)易得，大大節(jié)約成本，類胡蘿卜素的產(chǎn)出量也毫不遜色，在大規(guī)模的工廠發(fā)酵中需要大膽的嘗試，真正做到變廢為寶。

2.1.4 加入非離子表面活性劑

非離子表面活性劑像spans，tweens，Triton X-100和pluoronic F-68等被報(bào)道具有提高酶活性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。多數(shù)的非離子表面活性劑對(duì)類胡蘿卜素的產(chǎn)生具有一定的刺激作用，但以span-20效果最為明顯，span-20能促使三孢布拉霉菌絲體生長(zhǎng)，使菌絲體的形體分散，防止菌絲抱團(tuán)形成球，這種分散的菌絲體形式更有利于細(xì)胞間物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，促使類胡蘿卜素的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中存在1%的span-20時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量和三孢酸的合成量都提高了15倍左右[30]，但是span-20自身的起泡性影響到其在較大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.1.5 其他

乙酸鹽、乙烯、花生四烯、生物堿、胺類、異戊烯醇、甲羥戊酸、香葉醇等均會(huì)在一定程度上刺激三孢布拉霉提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。其中作用比較顯著的有，GOVIND N S等[31]報(bào)道稱10-8mol/L的銅離子刺激β-胡蘿卜素產(chǎn)量提升2.2倍，JING K等[32]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中存在35 mol/L的醋酸鈉時(shí)，刺激β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提升80%。

雖然多數(shù)外源添物對(duì)類胡蘿卜素的合成有著明顯的刺激作用，但是在選擇的時(shí)候也應(yīng)該考慮添加物的毒害性、對(duì)發(fā)酵體系的影響大小、后期分離的難易程度等諸多方面，以求達(dá)到最大的效益。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

B.trispora（-）的孢子萌發(fā)比B.trispora（+）的快，然而負(fù)菌萌發(fā)后菌絲體的生長(zhǎng)速度比正菌慢很多，正菌和負(fù)菌接種時(shí)按照不同的接種量比率和接種時(shí)間更有益于培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分在正、負(fù)菌之間的分配。BOHME K等[18]在負(fù)菌接種20 h后，以負(fù)菌接種量的1/30來(lái)接種正菌，所獲得的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量最高。當(dāng)然BOHME K所得到的最優(yōu)的接種時(shí)間和接種比例比不是絕對(duì)的，菌絲體在不同的環(huán)境中生長(zhǎng)和生產(chǎn)速度不同，其最優(yōu)的接種時(shí)間和接種比例也會(huì)有一定的變化。所以在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，要根據(jù)實(shí)際情況，如發(fā)酵裝置，發(fā)酵培養(yǎng)基等對(duì)菌絲體生長(zhǎng)得影響，不斷進(jìn)行優(yōu)化嘗試，以找到最優(yōu)的接種方式。此外，KIMSW等[33]在報(bào)道中提到，培養(yǎng)基的pH在10～11的范圍較對(duì)照（pH4～9）所得的β-胡蘿卜素產(chǎn)量高出近2倍，NANOU K等[34]，將發(fā)酵的初始pH調(diào)至11再進(jìn)行滅菌有利于β-胡蘿卜素的積累。

2.3 發(fā)酵罐中的生產(chǎn)優(yōu)化

在優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中，生物反應(yīng)裝置的類型（搖瓶、攪拌式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等）對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響不可小覷。搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素雖然發(fā)酵條件易于優(yōu)化和控制，但生產(chǎn)力低并不適用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，三孢布拉霉在大型發(fā)酵罐中的生產(chǎn)優(yōu)化就成了必然。攪拌發(fā)酵罐中通氣量，攪拌速率均顯著影響著生物量以及β-胡蘿卜素濃度。MANTZOURIDOU F等[35]報(bào)道，在5 L攪拌發(fā)酵罐中，低葉輪速度（150 r/min）和高通氣速率（1.5 vvm）下可獲得最高的β-胡蘿卜素產(chǎn)量（1.5 kg/m3）和最高的生產(chǎn)率（0.08 kg/（m3·d），而在高攪拌速度（500 r/min）和中等曝氣速率（1.0 vvm）條件下實(shí)現(xiàn)最大生產(chǎn)率（每天0.08 kg/m3）和生物干質(zhì)量（26.4 kg/m3）。LIU X J等[36]從7.5 L的攪拌罐逐步擴(kuò)大等級(jí)至200 L，番茄紅素的生產(chǎn)能力基本保持不變（0.18 mg/mL），添加脫落酸等外源刺激物發(fā)酵4 d后，獲取最高的番茄紅素產(chǎn)量（0.27 g/L）。攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)基流動(dòng)性強(qiáng)，便于物質(zhì)交換和營(yíng)養(yǎng)吸收，利于類胡蘿卜素生產(chǎn)，但是攪拌發(fā)酵罐中葉輪攪拌帶來(lái)的剪切力會(huì)打斷菌絲體，影響菌絲體正常生長(zhǎng)，降低類胡蘿卜素的產(chǎn)量。在氣升式發(fā)酵罐中的研究中，ROUKAS T等[37]使用脫去蛋白質(zhì)的水解乳清為培養(yǎng)基，在1.4 L氣升式反應(yīng)器中以較高的通氣速率（4vvm）發(fā)酵獲得最高類胡蘿卜素的產(chǎn)量（55.5 mg/（L·d））。氣升式反應(yīng)器耗能少，更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保，沒有攪拌發(fā)酵中的機(jī)械攪拌，減小對(duì)菌絲體損傷，溶氧效率高，可以通過(guò)增加氧分壓引起菌絲體氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加類胡蘿卜的產(chǎn)量。此外，ROUKAS T等[38]使用的一種改進(jìn)的旋轉(zhuǎn)生物膜反應(yīng)器，與傳統(tǒng)的攪拌發(fā)酵罐相比，其所獲得的類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高近6倍，而且在較短的時(shí)間內(nèi)能實(shí)現(xiàn)大量的類胡蘿卜素的積累，所獲得最大胡蘿卜素生產(chǎn)力為（0.57 mg/（mL·d）），是迄今為止報(bào)告過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素效率最高的一種生產(chǎn)方式，更適合工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素。

3 小結(jié)與展望

隨著人們對(duì)生活品質(zhì)的重視，綠色食品和保健食品的銷量在日益增加，類胡蘿卜素以其具有著色、抗氧化、抗衰老、預(yù)防癌癥等功能而廣泛受到市場(chǎng)青睞，具有很好的商業(yè)前景。但是，目前類胡蘿卜的產(chǎn)量仍然較低，難以滿足市場(chǎng)的需求。盡管提高三孢布拉霉類胡蘿卜素產(chǎn)量的策略多樣，但是多數(shù)仍停留在實(shí)驗(yàn)室的水平上。發(fā)酵調(diào)控方面的工作是比較容易快速提高產(chǎn)量的途徑，現(xiàn)階段可以尋找適合的外源刺激物來(lái)提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，嘗試多種不同外源刺激物共同作用，同時(shí)尋找合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式達(dá)到提高類胡蘿卜素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看要實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)還要以菌株的改良選育為主，誘變育種雖然工作繁瑣、成效偏低，但是必不可少，以N+離子注入和ARTP誘變等結(jié)合傳統(tǒng)的化學(xué)誘變手段獲得高產(chǎn)類胡蘿卜素的突變株以初見成效。隨著功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的完善和發(fā)展，闡明三孢布拉霉產(chǎn)類胡蘿卜素的代謝調(diào)控機(jī)制將是之后工作的主要內(nèi)容，運(yùn)用基因編輯技術(shù)改造關(guān)鍵基因獲取理想的工程菌株也將成為今后工作中的重點(diǎn)。