腎衰方及其拆方對(duì)MMP7、α-SMA調(diào)節(jié)作用的探討

沈金峰，黃偉，晏子友

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006)

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末腎衰的共同轉(zhuǎn)歸，是腎功能衰竭的主要病理表現(xiàn)。延緩腎臟疾病進(jìn)展的主要方法是改善腎間質(zhì)纖維化的病理變化。本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化小鼠模型，觀(guān)察了腎衰方對(duì)MMP7、α-SMA表達(dá)的作用及其抗腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與造模

SPF級(jí)雌性大鼠72只(購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCSK(浙)20170001 )，體質(zhì)量180～200 g，適應(yīng)1周，尿蛋白陰性者方可使用。按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腎衰方組、補(bǔ)虛方組、袪邪方組、貝那普利組，每組12只。UUO動(dòng)物模型參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行，即以5.0%水合氯醛(10 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后，于左側(cè)中腹部切開(kāi)皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在腎盂處和輸尿管上1/3處用絲線(xiàn)結(jié)扎后，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚即可。假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎及切斷輸尿管。

1.2 藥物與試劑

腎衰方組(生黃芪30 g，生地黃10 g，黨參15 g，山萸肉10 g，淮山藥15 g，丹參20 g，澤瀉10 g，土茯苓20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，生大黃后下10 g，淫羊藿15 g,共12味中藥)、補(bǔ)虛方組(生黃芪30 g，黨參15 g，生地黃10 g，山萸肉10 g，山藥15 g，淫羊藿15 g,共7味中藥)、袪邪方組(生大黃10 g，丹參20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，土茯苓20 g，澤瀉10 g,共6 味中藥)三組，所有中藥均由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠(chǎng)專(zhuān)家鑒定后提供，常規(guī)方法水煎，分別濃縮成每毫升含生藥量1.2 g、0.4 g、0.8 g三種劑量，4℃冰箱保存。由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制備。鹽酸貝那普利(商品名：洛丁新)由北京諾華制藥有限公司提供,規(guī)格10 mg/片，批號(hào)：H2003014。

兔抗大鼠MMP7單抗、兔抗大鼠α-SMA單抗均由武漢博士德生物工程有限公司提供，以1∶100稀釋。Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、免疫組化超敏SP試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供；磷酸緩沖液(PBS)由檸檬酸緩沖液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 給藥方法

手術(shù)后第3天，各中藥組及貝那普利大鼠給藥均按10倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量給藥，即腎衰方組、補(bǔ)虛方組和祛邪方組大鼠分別按分別按1.95 g/mL、0.95 g/mL、1.00 g/mL腎衰方濃縮劑給藥，即給藥劑分別為19.5 g/kg·d、9.5 g/kg·d、10.0 g/kg·d灌胃(均相當(dāng)于成人劑的10倍)；予貝那普利組大鼠貝那普利1.5 mg/kg·d灌胃(相當(dāng)于成人劑量的10倍)，假手術(shù)組和模型組大鼠給等量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于手術(shù)后第7天、第14天處死。

1.4 觀(guān)察與檢測(cè)方法

1.4.1 一般情況觀(guān)察

觀(guān)察各組大鼠飲食、體質(zhì)量、計(jì)算左腎(術(shù)側(cè))濕重、腎臟器系數(shù)(腎濕重/體質(zhì)量×100%)；

1.4.2 腎組織學(xué)檢查

大鼠處死后，迅速取出術(shù)側(cè)腎臟，稱(chēng)重。腎組織經(jīng)4%福爾馬林液浸泡固定，脫水，石蠟包埋，制成約4 μm 厚切片，做HE及Masson染色，光鏡下觀(guān)察腎臟組織學(xué)變化。每組隨機(jī)取1只大鼠，活體取術(shù)側(cè)腎髓質(zhì)一小塊(0.5 mm3)新鮮組織經(jīng)2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定，Epon812包埋，醋酸鈾-枸椽酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀(guān)察。

1.4.3 腎小管損傷程度評(píng)分及腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)測(cè)定

HE染色評(píng)定[2]：光學(xué)顯微鏡觀(guān)察(×400 倍)，依據(jù)每個(gè)視野腎小管病變(腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等)累及的小管數(shù)目評(píng)定腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)損傷按 Banff分級(jí)進(jìn)行0～3級(jí)半定量計(jì)分。0分：腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)病變；1分：腎小管病變數(shù)目<3個(gè)；2分：腎小管病變數(shù)目3～5個(gè)；3分：腎小管病變數(shù)目>5個(gè)或腎小管結(jié)構(gòu)消失。每張切片隨機(jī)選取 10個(gè)視野不相重疊的皮質(zhì)處腎小管，每只大鼠選5張組織切片，最后取平均值。Masson染色半定量分析[3]：在400倍視野下，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的腎皮質(zhì)處腎小管間質(zhì)視野，取平均值。根據(jù)視野中膠原染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比評(píng)定腎間質(zhì)纖維化指數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，纖維化陽(yáng)性面積<2%；1分，纖維化陽(yáng)性面積2%～10%；2分，纖維化陽(yáng)性面積 11%～20%；3分，纖維化陽(yáng)性面積 21%～30%；4分，纖維化陽(yáng)性面積>30%。

1.4.4 免疫組化檢測(cè)

用SP法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠腎間質(zhì)MMP7、α-SMA的蛋白表達(dá)。每組取8只大鼠的術(shù)側(cè)腎臟，嚴(yán)格按SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化技術(shù)操作，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。免疫組化結(jié)果借助用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖象分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，對(duì)所選視野內(nèi)的免疫組化陽(yáng)性信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析，通過(guò)積分吸光度值反映蛋白表達(dá)的高低。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀(guān)察及病理檢查

外觀(guān)性觀(guān)察：模型組大鼠的皮毛松軟、灰暗，消瘦，厭食，少動(dòng)。治療組大鼠的飲食、體質(zhì)量、存活率、活動(dòng)情況無(wú)顯著差異，但整體狀況均比模型組稍好。

肉眼觀(guān)察：假手術(shù)組大鼠腎臟表面光滑，顏色鮮紅，質(zhì)脆柔軟。術(shù)后第7天、第14天無(wú)明顯變化；UUO大鼠造模術(shù)側(cè)腎臟體積大于對(duì)側(cè)，顏色變淡，剖面表現(xiàn)出缺血狀，腎皮質(zhì)為尤為明顯。腎盂、腎盞擴(kuò)張明顯，內(nèi)含尿液，腎實(shí)質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)邊界模糊不清。術(shù)后第7天變化不明顯，術(shù)后第14天出現(xiàn)明顯變化。模型組及各治療組大鼠術(shù)側(cè)腎臟顏色蒼白，有的可見(jiàn)一層薄萎縮樣纖維化腎組織，內(nèi)有大量積水，乳頭呈空洞狀，腎濕重較假手術(shù)組減輕。非術(shù)側(cè)大鼠腎臟術(shù)后第7天、第14天較假手術(shù)組變化不明顯。各治療組大鼠腎臟在色澤、大小、質(zhì)地、積水程度方面都較模型組略有好轉(zhuǎn)。

各組大鼠左側(cè)腎腎臟器系數(shù)(腎濕重/體質(zhì)量×100%)比較：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與假手術(shù)組，同時(shí)期模型組左腎臟器指數(shù)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明左腎衰竭模型成功制備。與模型組相比，腎衰方及其拆方組和貝那普利組臟器指數(shù)升高(P<0.05)，其中第14天腎衰方組大鼠術(shù)側(cè)腎腎臟器系數(shù)明顯高于其他三個(gè)治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

大鼠腎臟病理改變：HE染色見(jiàn)假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列緊密，腎小管周?chē)g質(zhì)無(wú)增寬；模型組大鼠術(shù)后第7天起觀(guān)察到腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管周?chē)g質(zhì)增寬、水腫并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)更加嚴(yán)重。但梗阻早期(術(shù)后第7天)腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，各治療組大鼠較同期模型組上述病變有所改善。模型組及各治療組較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，模型組與治療組比較亦有顯著差異(P<0.05)，且第14天腎衰方組大鼠腎小管損傷程度評(píng)分低于其他三個(gè)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。Masson染色見(jiàn)假手術(shù)組大鼠腎小球基底膜、系膜區(qū)及腎小管間質(zhì)無(wú)明顯膠原沉積；模型組大鼠腎臟見(jiàn)增寬的間質(zhì)充滿(mǎn)著大量藍(lán)紫色條索狀膠原，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)加重。各治療組大鼠較同期模型組膠原沉積明顯減少。模型組及各治療組較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，模型組與治療組比較亦有顯著差異(P<0.05)，且第14天腎衰方組腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯低于其他三個(gè)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠術(shù)側(cè)腎腎臟器系數(shù)變化比較

注：與同時(shí)期假手術(shù)組比較，*P<0.05；與同時(shí)期模型組比較,#P<0.05；與同時(shí)期其他三個(gè)治療組比較,※P<0.05

2.2 各組大鼠術(shù)側(cè)腎臟組織MMP7、α-SMA蛋白表達(dá)比較

如表3，MMP7蛋白在假手術(shù)組大鼠腎小管間質(zhì)僅見(jiàn)于少量的陽(yáng)性表達(dá)，造模后，腎小球系膜和基底膜也出現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。隨著手術(shù)時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP7表達(dá)減少，腎間質(zhì)纖維化病理程度逐漸加重。經(jīng)治療后，各治療組MMP7蛋白表達(dá)均有所增加，以腎衰方組更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。術(shù)后第14天，腎衰方組>祛邪方>補(bǔ)虛方阻>貝那普利組增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)較少；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠術(shù)后第7天α-SMA蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05)，隨著梗組時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA蛋白表達(dá)的增多更明顯(P均<0.05)。治療后各治療組α-SMA蛋白的表達(dá)有所下降，以術(shù)后第14天更明顯(P均<0.05),尤以腎衰方組更佳(P均<0.05)。

表2 各組大鼠腎小管損傷程度評(píng)分及腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)

注：與同時(shí)期假手術(shù)組比較，*P<0.05；與同時(shí)期模型組比較,#P<0.05；與同時(shí)期其他三個(gè)治療組比較，※P<0.05

表3 各組大鼠腎組織MMP-7、α-SMA蛋白表達(dá)

注：與同時(shí)期假手術(shù)組比較，*P<0.05；與同時(shí)期模型組比較,#P<0.05；與同時(shí)期其他三個(gè)治療組比較，※P<0.05

3 討論

我們團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)多年的臨床及實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為腎纖維化的病機(jī)歸納為“虛”“濕”“瘀”“毒”四個(gè)方面，“虛”是始因，濕、瘀是腎纖維化微型癥積形成的病理基礎(chǔ)，而毒促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。本病為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以脾腎虧虛為主；標(biāo)實(shí)以濕濁、痰瘀、濁毒為主。在早期，標(biāo)實(shí)為主，以祛濕泄?jié)?，活血化瘀為法，到了晚期，正氣耗傷，?dāng)以扶正為主，補(bǔ)益脾腎，泄?jié)峤舛尽２C(jī)關(guān)鍵是“脾腎虧虛、濕濁內(nèi)蘊(yùn)，瘀毒閉阻”，故治療以益腎健脾、化瘀利濕、解毒泄?jié)釣榉?。腎衰方正是依據(jù)此病機(jī)研制而成，由生黃芪、生地黃、黨參、山萸肉、淮山藥、丹參、澤瀉、土茯苓、白花蛇舌草、六月雪、生大黃、淫羊藿組成。方中用丹參易丹皮增強(qiáng)活血化瘀之功效，以黨參代人參補(bǔ)中益氣，合黃芪健運(yùn)脾陽(yáng)，布施精微，生地黃益陰血、山萸肉補(bǔ)肝腎、山藥健脾固腎滋精、澤瀉利水滲濕、茯苓健脾利水，諸藥合用既可益氣固腎澀精，以護(hù)其本；又可健脾補(bǔ)腎填精，以培其源，配以苦寒生大黃，泄?jié)岫?、破積滯、行瘀血，使?jié)岫緩哪c胃而出、白花蛇舌草清熱解毒、六月雪健脾利濕，活血及溫而不燥的淫羊藿溫腎陽(yáng)而補(bǔ)腎氣，全方組方嚴(yán)格，緊扣病機(jī)，益腎而不留邪，降濁而不傷正，補(bǔ)中有瀉，寓瀉于補(bǔ)，以標(biāo)本同治之，具有益腎、解毒、化瘀的功效。 補(bǔ)虛方組(生黃芪、黨參、生地黃、山萸肉、山藥和淫羊藿共7味中藥)、袪邪方組(生大黃、丹參、白花蛇舌草、六月雪、土茯苓、澤瀉共6味中藥)，通過(guò)拆方進(jìn)行治療，進(jìn)一步佐證腎間質(zhì)纖維化是否為本虛標(biāo)實(shí)之證。

肌成纖維細(xì)胞與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生關(guān)系最為密切，而腎間質(zhì)固有成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源之一，腎間質(zhì)纖維化(RIF)以成纖維細(xì)胞的增生及膠原、各種連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積為主要表現(xiàn)。α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，是間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為α-SMA的肌成纖維細(xì)胞關(guān)鍵步驟[4]，這是腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腎間質(zhì)可見(jiàn)ECM大量沉積，α-SMA蛋白表達(dá)激活，腎臟器系數(shù)顯著降低，腎組織嚴(yán)重病理?yè)p害，出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化。經(jīng)治療后，α-SMA蛋白表達(dá)顯著減少，腎間質(zhì)沉積的ECM明顯降低， 腎臟器系數(shù)顯著升高，腎組織病理檢查也有所改善，尤以腎衰方組治療效果最佳，腎衰方>祛邪方>補(bǔ)虛方>貝那普利。

MMPs直接以酶原的形式分泌到EMC中，并在正常生理?xiàng)l件下起到降解細(xì)胞外基質(zhì)的功效。MMPs 的這一作用運(yùn)用在預(yù)防或治療疾病，現(xiàn)已在各個(gè)系統(tǒng)疾病中被廣泛研究[5]。而MMP-7 是MMP家族中分子量最小的一類(lèi)，有著強(qiáng)大的降解作用，包括構(gòu)成基底膜的基質(zhì)成分在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)。大量的研究證實(shí)，MMP-7 通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分[6]。在腎纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌MPP7進(jìn)而抑制ECM降解，促進(jìn)腎小鼠組織纖維化進(jìn)程[7]。通過(guò)促進(jìn)MPP7表達(dá)，從而對(duì)腎間質(zhì)纖維化起到預(yù)防及逆轉(zhuǎn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎間質(zhì)MPP7表達(dá)明顯降低，膠原沉積則顯著增多，經(jīng)腎衰方治療后，可明顯上調(diào)MPP7表達(dá)量，從而減少膠原的過(guò)度沉積，腎間質(zhì)纖維化程度降低。尤以腎衰方組效果更佳。腎衰方>祛邪方>補(bǔ)虛方>貝那普利。說(shuō)明腎間質(zhì)纖維化時(shí)，隨著藥物誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的MPP7增加，也進(jìn)一步證實(shí)了腎間質(zhì)纖維化屬于本虛標(biāo)識(shí)之證，治療需標(biāo)本兼顧。

中藥腎衰方抗腎間質(zhì)纖維化作用機(jī)制可能作用機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)腎間質(zhì)MPP7蛋白的表達(dá)，抑制α-SMA蛋白的表達(dá)，從而抑制ECM的積聚，延緩纖維化進(jìn)展，且腎間質(zhì)纖維化為本虛標(biāo)實(shí)之證。