辣木葉復(fù)方改善小鼠睡眠功能的實驗研究

張久旭，劉洋，顧文宏，李夢薇，何軍，趙保勝*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488； 2.云南天佑科技開發(fā)有限公司，云南 芒市 678400)

辣木葉為辣木科辣木屬植物辣木(MoringaoleiferaLam)的干燥葉子，全世界約有14個辣木品種[1]。辣木葉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和藥效成分，在印度已有上千年的食用歷史，其提取物被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品中[2-4]。研究表明辣木葉具有降血糖、降脂、降壓、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、利尿、驅(qū)蟲等作用[5-9]。

失眠，中醫(yī)稱為 “不寐”，主要是由氣血陰陽失和或其他病證影響所致。而辣木改善睡眠作用的功效國外早已發(fā)現(xiàn)，并進行了相關(guān)的研究。通過實驗發(fā)現(xiàn)辣木根的水提物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，在一定的劑量下可以降低大鼠的自發(fā)性活動[10]，辣木根的甲醇提取物也可以明顯延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠時間[11-12]。

目前，改善睡眠的中藥復(fù)方以酸棗仁、五味子、茯苓、當(dāng)歸、遠志、甘草、丹參等藥物使用為主，其中安神類保健食品的主要成分為酸棗仁提取物和五味子提取物[13-15]。實驗所采用的辣木葉復(fù)方由辣木葉與酸棗仁、五味子、遠志、丹參組成。本文通過戊巴比妥鈉小鼠睡眠時間實驗和巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期實驗，觀察辣木葉和辣木葉復(fù)方對小鼠睡眠功能的影響，并觀察不同配伍比例的辣木葉復(fù)方改善睡眠的作用。辣木葉的作用廣泛，但多用于功能食品，對于藥效學(xué)研究相對較少。本研究有望證明其對亞健康的確切療效，為辣木葉及其復(fù)方成藥性提供實驗依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HH-2恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市晨陽電子儀器廠)；DZF真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200超聲波清洗儀器(300 w，40 kHz，寧波新芝生物科技股份有限公司)；島津高效液相色譜儀(LC-16，日本島津公司)；CPA225D電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 試劑與藥材

辣木葉(由合作企業(yè)云南天佑科技開發(fā)有限公司提供)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為辣木科植物辣木MoringaoleiferaLam的干燥葉；酸棗仁(批號：1503009)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubeMill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子；五味子(批號：1702047)，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill. 的干燥成熟果實；遠志(批號：17020448)，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為遠志科植物遠志PolygalasibiricaL.的根；丹參(批號：1701027)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根；以上四種飲片均由北京太洋樹康中藥飲片廠提供。戊巴比妥鈉(分析純，批號：20170611)購買于上海伊卡生物技術(shù)有限公司；巴比妥鈉(分析純，批號：570471)購買于北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司，批號：164790)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號：20170209)；磷酸(分析純，北京化工廠，批號：20160111)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司，批號：201102GQ07547)；異槲皮苷(純度92.9%，111809-201403)購買于中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(純度99.5%，批號：Y27J7H9634)購買于上海源葉生物科技有限公司；丹酚酸B(純度99.5%,批號：ST00050120MG)購買于上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 實驗動物與分組

SPF級ICR小鼠180只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由北京斯貝福生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0002。實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水和進食。

將ICR小鼠按體質(zhì)量隨機分為延長戊巴比妥鈉睡眠時間和縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期兩個實驗組，每個實驗組90只，雌雄各半。每個實驗組又按體質(zhì)量隨機分為模型對照組、辣木葉低劑量(1.3 g/kg)組、辣木葉中劑量(2 g/kg)組、辣木葉高劑量(2.6 g/kg)組，酸丹五遠組(1.2 g/kg)，復(fù)方組合①(辣木葉1.3 g/kg+酸丹五遠1.2 g/kg)組、復(fù)方組合②(辣木葉2 g/kg+酸丹五遠1.2 g/kg)組、復(fù)方組合③(辣木葉2.6 g/kg+酸丹五遠1.2 g/kg)組，共8組，每組10只。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取異槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B10.23 mg于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，做儲備液。精密吸取異槲皮苷儲備液1.74 mL，紫云英苷儲備液0.94 mL，丹酚酸B儲備液0.96 mL于5 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，做混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

分別取辣木葉中劑量組提取物、酸丹五遠提取物、不用配伍比例辣木葉復(fù)方提取物各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇溶液，稱重。超聲30 min后取出，冷卻至室溫，再次稱重，加入純甲醇補足缺失的重量。用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為B(乙腈)-A(0.1%磷酸水)，梯度洗脫，洗脫程序為：0 min 20%B，16 min 20%B，26 min 40%B，29 min 40%B，30 min 20%B，36 min 20%B，流速為1.3 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為260 nm，進樣量為10 μL。

2.4 受試藥物的制備

辣木葉提取物的制備：稱取辣木葉97.93 g于2 000 mL圓底燒瓶，加入100 mL蒸餾水，浸泡2 h?；亓魈崛? h，保持微沸狀態(tài)，用紗布過濾，收集初濾液，再加入1 000 mL蒸餾水，回流提取2 h，合并兩次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉提取物。

辣木葉復(fù)方提取物的制備：以2倍處方量稱取各藥材(辣木葉、酸棗仁、丹參、遠志、五味子)按不同的實驗設(shè)計分別進行加熱回流提取，放冷后過濾，靜置過夜，去除沉淀得澄清液體，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉復(fù)方提取物。

去辣木葉復(fù)方提取物的制備：以2倍處方量稱取各藥材(酸棗仁、丹參、遠志、五味子)，按不同的實驗設(shè)計分別進行加熱回流提取，放冷后過濾，靜置過夜，去除沉淀得澄清液體，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到去辣木葉復(fù)方提取物。

2.5 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

每天上午8-10點按體質(zhì)量灌胃給藥，模型對照組給予等積體的蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥2周。于最后一次給藥后30 min，各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失30 s以上作為進入睡眠的判斷標準，以翻正反射再現(xiàn)為睡眠結(jié)束，觀察記錄注射戊巴比妥鈉后各組小鼠的睡眠時間(翻正反射消失至翻正反射再現(xiàn)的時間)，進行組間比較。

2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

每天上午8-10點按體質(zhì)量灌胃給藥，模型對照組給予等積體的蒸餾水，連續(xù)給藥2周。于末次給藥后30 min，各組小鼠按250 mg/kg腹腔注射巴比妥鈉，以翻正反射消失30 s以上作為入睡判斷標準，以翻正反射再現(xiàn)為睡眠結(jié)束，觀察記錄注射催眠劑量巴比妥鈉后各組小鼠的睡眠潛伏期(注射巴比妥鈉至翻正反射消失的時間)，進行組間比較。

2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗

在“2.3”色譜條件下測得空白輔料、對照品和辣木葉、去辣木葉組、及辣木葉復(fù)方譜圖見圖1，各樣品含量見表2，對照品異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B，保留時間分別為9.985、14.872、24.973 min，表明該體系中輔料和其它成分均不干擾待測物的測定。從高效液相色譜法含量測定結(jié)果來看，按日服用生藥量計算，三個復(fù)方組合中異槲皮苷和紫云英苷較單味藥辣木葉的含量有所下降，只有復(fù)方組合③的異槲皮苷含量明顯增高，但是丹酚酸B的含量在三個復(fù)方中都有所增高，以復(fù)方組合②最為顯著。

圖1 HPLC色譜圖

樣品異槲皮苷含量(mg·g-1)紫云英苷含量(mg·g-1)丹酚酸B含量(mg·g-1)辣木葉低劑量31.82915.549—辣木葉中劑量48.96823.921—辣木葉高劑量63.65931.097—酸丹五遠——14.74復(fù)方組合①22.81710.41918.304復(fù)方組合②42.77620.97463.499復(fù)方組合③88.71318.13927.387

3.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

腹腔注射戊巴比妥鈉后，模型組小鼠均出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。給藥2周后，與模型組比較，辣木葉復(fù)方組合①和②均明顯延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠持續(xù)時間(P<0.05或P<0.01)；而辣木葉低劑量、中劑量、高劑量組以及酸丹五遠組及復(fù)方組合③組與模型組比較，小鼠睡眠持續(xù)時間有延長趨勢，但未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，具體結(jié)果見表1。

表1 辣木葉及其復(fù)方對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠持續(xù)時間的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

腹腔注射巴比妥鈉后，模型組小鼠均出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。各給藥組與模型組比較，小鼠的睡眠潛伏期均明顯縮 短，差異具有顯著性(P<0.001)，具體結(jié)果見表2。

表2 辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

注：與模型組比較,**P<0.01

4 討論

辣木葉是藥食同源的植物，在國外具有悠久的藥用歷史，廣泛用于羅馬人、希臘人和以及烏納尼人和錫達人的醫(yī)療系統(tǒng)，我國于20世紀60年代引入辣木，目前在云南和廣東等地有所種植[16-18]。國內(nèi)對辣木葉的藥用價值研究相對較少，目前大部分的研究認為與其藥效作用相關(guān)的化學(xué)成分主要是辣木葉中的黃酮類和多酚類，但其確切的有效成分和作用機制還尚不清楚[19]。本實驗選取辣木葉中含量較高的成分異槲皮苷和紫云英苷做為指標性成分，其中異槲皮苷具有一定的抗氧化、抗腫瘤和抗血小板凝集作用，從而具有一定的大腦保護作用[20]，紫云英苷則具有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗肝毒、抗心律失常、擴張血管、保護心肌的作用[21]，這些作用可能與其改善睡眠的機制有關(guān)。而丹酚酸B是丹參提取物中的主要水溶性成分之一，研究表明丹酚酸B具有多種藥理作用，能夠改善心肌缺血，同時對心肌梗死具有很好的保護作用[22]，在治療心脾兩虛型的失眠癥中有很好的療效[23]。

在三個不同配伍比例的辣木葉復(fù)方中，藥理作用顯著的復(fù)方②在三個化合物的含量上，紫云英苷和丹酚酸B的含量較高，而異槲皮苷含量適中，可見中藥復(fù)方的藥效并不是與化合物含量呈絕對正相關(guān)，與其配伍比例有著重量的聯(lián)系。方藥配伍比例的變化嚴重影響了其功效，同樣的配伍在使用不同的配伍劑量后，可能會產(chǎn)生不用的藥理效應(yīng)，甚至改變方藥的藥效，故而有“漢方不傳之秘在量上”之說[24]。因此配伍比例的研究也是探討配伍規(guī)律的一個重要方面。

在延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗中，辣木葉組和酸丹五遠組與模型組相比沒有顯著性差異，但是出現(xiàn)了延長睡眠時間的趨勢，說明其具有一定的改善睡眠功效。辣木葉復(fù)方組則出現(xiàn)了明顯的延長睡眠時間的作用，尤其是辣木葉復(fù)方②的作用更為明顯，說明辣木葉與酸丹五遠可能存在協(xié)同作用。

在巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中，各實驗組與模型組比較均有顯著性差異，且辣木葉復(fù)方②更為明顯。從以上研究中分析，辣木葉復(fù)方具有改善睡眠功能的作用，其中以辣木葉復(fù)方組合②(辣木葉2 g/d+酸丹五遠1.2 g/d)的作用更為明顯。以上研究對于探討辣木葉復(fù)方改善睡眠作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定參考意義，為辣木葉改善睡眠復(fù)方的進一步深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

隨著時代的發(fā)展，生活壓力的增大，越來越多的人患有失眠癥。針對失眠癥的綜合治療方法中，中藥具有我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特色與優(yōu)勢，安全性高、療效較好，特別是中藥類保健食品與藥膳的可接受性強、無毒副作用，長期使用對失眠癥確有一定療效。實驗證明，辣木葉復(fù)方對睡眠有一定的改善作用，但其改善睡眠作用的藥理機制還有待于進一步深入研究。