重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)肝硬化大鼠外周血 干細(xì)胞動(dòng)員的研究

摘要：目的：觀察重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）對(duì)四氯化碳（CCL4）肝硬化大鼠外周血中CD34+細(xì)胞的動(dòng)員作用，以及對(duì)肝硬化大鼠肝臟生化學(xué)的影響，尋求一種安全有效、不加重肝損傷的動(dòng)員CD34+細(xì)胞的方法。方法：50%CCL4橄欖油溶液建立肝硬化大鼠模型，rhG-CSF動(dòng)員組大鼠皮下注射rhG-CSF10gkg-1d-1，共計(jì)5d，對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水。流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞的比例，同時(shí)檢測(cè)ALT、AST、T-BIL和ALB，觀察G-CSF對(duì)肝硬化大鼠肝臟的影響。結(jié)果：肝硬化大鼠rhG-CSF動(dòng)員后外周血CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞（CD34+/MNC）比例（4.081.38）%是生理鹽水對(duì)照組（0.430.21）%的9.5倍；而生化學(xué)檢測(cè)兩組沒有顯著性差異。結(jié)論：G-CSF動(dòng)員能促進(jìn)更多的骨髓/造血干細(xì)胞源性的肝干細(xì)胞在外周血中表達(dá)，而且不加重肝硬化大鼠的肝臟損傷。

關(guān)鍵詞：粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）；干細(xì)胞；CD34細(xì)胞動(dòng)員

肝炎病毒、酒精、藥物、化學(xué)物質(zhì)以及遺傳代謝等等諸多原因皆可以損傷肝臟功能，最終表現(xiàn)為肝硬化、肝功能衰竭等終末期肝臟病變，嚴(yán)重危害人們的身體健康。終末期肝病一般需要肝移植才能徹底解決，但是由于肝臟供體來(lái)源受限，人們逐漸嘗試肝干細(xì)胞替代治療的方法來(lái)讓病人度過(guò)手術(shù)等待期，或用這種方法進(jìn)行肝臟病人的治療。

目前認(rèn)為肝臟干細(xì)胞主要有肝源性和非肝源性兩個(gè)方面的來(lái)源。肝源性肝干細(xì)胞主要為肝卵圓細(xì)胞（hepaticovalcell，HOC）。HOC是從小鼠肝臟中分離出來(lái)的，當(dāng)各種致病因素使肝細(xì)胞增殖受限時(shí)，HOC可進(jìn)一步分化為肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，因而認(rèn)為是一種肝干細(xì)胞?，F(xiàn)在已經(jīng)有證據(jù)表明至少有一部分HOC是由骨髓源前體細(xì)胞演變而來(lái)。Crosby采用骨髓造血干細(xì)胞標(biāo)志c-Kit和CD34觀察肝硬化患者肝組織存在著CD34+細(xì)胞，其主要位于膽管周圍的門靜脈區(qū)。因此，HOC是一類具有骨髓干細(xì)胞的某些表型、克隆原性及雙向分化潛能的細(xì)胞。

骨髓/造血干細(xì)胞可以由骨髓、臍帶血和外周血三種來(lái)源獲得。外周血造血干細(xì)胞有著收集方便、來(lái)源廣泛、供體不需要麻醉、創(chuàng)傷小以及易于患者接受等優(yōu)勢(shì)，因而受到了越來(lái)越多的重視。

本研究是通過(guò)粒細(xì)胞集落刺激因子（granularcellstimu latingfactor，G-CSF）對(duì)四氯化碳（CCL4）致肝硬化大鼠進(jìn)行動(dòng)員，檢測(cè)肝臟以及外周血中CD34+細(xì)胞表達(dá)的變化，觀察G-CSF對(duì)外周血干細(xì)胞的動(dòng)員作用，同時(shí)觀察動(dòng)員的肝硬化大鼠肝臟的生化學(xué)、組織病理學(xué)改變，評(píng)價(jià)G-CSF對(duì)肝硬化大鼠機(jī)體的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體重180～220g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫22～26，飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及藥品

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、兔抗鼠CD34抗體、FITC-羊抗兔IgG抗體、RPMI1640、胎牛血清和Ficoll分離液分別由日本麒麟株式會(huì)社、Santa-Cruz公司、Jackson公司、Gibco公司和Sigma公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

將36只大鼠隨機(jī)分為四組，正常組6只，不進(jìn)行任何處理。余30只進(jìn)行CCL4造模，造模成功后處死6只作為肝硬化模型組。對(duì)造模成功的大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和G-CSF動(dòng)員組各8只。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1肝硬化模型的制備

經(jīng)大鼠大腿內(nèi)側(cè)、背部、腹部皮下注射50%的橄欖油CCL4溶液（橄欖油與CCL4的體積比為1?1），劑量3mL/kg，1次/3d，測(cè)量大鼠體重，根據(jù)體重調(diào)整劑量，注射23次后停藥觀察大鼠體重，以不增加為準(zhǔn)，若仍體重增加，原量注射直至體重恒定。肝臟組織病理學(xué)證實(shí)模型成功。

1.4.2肝臟組織病理學(xué)檢查。對(duì)肝硬化模型建立的組織病理，使用石蠟切片。取造模大鼠肝臟右葉，切成1cm#1cm#0.5cm大小組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，5m切片，行HE染色和Masson染色。常規(guī)病理制片，顯微鏡下由同一名病理醫(yī)生閱片，找尋10步驟的拍攝區(qū)域普通顯微鏡拍照。

1.4.3G-CSF動(dòng)員

動(dòng)員組8只大鼠每天早晨9點(diǎn)鐘，皮下注射G-CSF10gkg- 1d-1，連續(xù)5d，對(duì)照組8只注射同劑量生理鹽水。

1.4.4肝功能生化學(xué)檢查

血清采集后-20！保存，一次上機(jī)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（T-BIL）和白蛋白（ALB），由同一全自動(dòng)生化分析儀完成。

1.4.5動(dòng)員后外周血CD34+細(xì)胞表達(dá)的評(píng)價(jià)

MNC的提取%流式細(xì)胞儀檢測(cè)MNC中CD34+細(xì)胞

1.4.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用SPSS10.0軟件對(duì)正常大鼠、肝硬化大鼠、G-CSF動(dòng)員后大鼠的ALT、AST、TBIL、ALB以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的CD34+細(xì)胞占MNC的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用xs（均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差）表示，方差齊時(shí)t檢驗(yàn)，方差不齊t檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肝硬化動(dòng)物模型的建立

30只大鼠使用50%CCL4造模過(guò)程中，死亡4只，死亡率13.3%。經(jīng)HE、Masson染色進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查，可見膠原纖維大量增生、包繞變性壞死肝細(xì)胞及大小不等的假小葉形成等，組織學(xué)證實(shí)肝硬化造模成功。50%CCL4皮下注射26次后，大鼠ALT，AST，TBIL都有不同程度的升高（P<0.01），白蛋白下降（P<0.01）。提示造模大鼠有明顯的肝功能損害。

2.2G-CSF動(dòng)員效果對(duì)比

使用流式細(xì)胞儀對(duì)周血中CD34+細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，動(dòng)員組肝硬化大鼠外周血中CD34+細(xì)胞占MNC比例為（4.081.38）%，是生理鹽水組（0.43+-0.21）%的9.5倍，P<0.01。

2.3使用rhG-CSF動(dòng)員與生理鹽水對(duì)照組生化指標(biāo)對(duì)比

兩組肝功能生化指標(biāo)（ALT、AST、ALB、TBIL）變化對(duì)比，無(wú)顯著性差異，P>0.05。

3討論

G-CSF是由Welte等在1985年克隆并純化的，由2個(gè)長(zhǎng)環(huán)和1個(gè)短環(huán)連接的4條反向平行的螺旋鏈組成。自90年代初獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用。目前認(rèn)為G-CSF動(dòng)員的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：?影響造血干細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)及功能，特異性誘導(dǎo)粒系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟，并抑制外周血造血干細(xì)胞的凋亡。下調(diào)骨髓微環(huán)境內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶釋放及降解細(xì)胞外基質(zhì)。G-CSF對(duì)CD34+細(xì)胞的動(dòng)員作用是呈動(dòng)態(tài)變化的。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)健康者皮下注射G-CSF，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量在第6天達(dá)到高峰，其數(shù)量與G-CSF用量相關(guān)。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝硬化大鼠G-CSF連續(xù)使用5d后，外周血中CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例較使用生理鹽水增加了9.5倍。G-CSF對(duì)肝硬化大鼠外周血中的CD34+細(xì)胞有很明顯的動(dòng)員作用，且沒有加重肝臟損傷的影響。目前，對(duì)肝硬化個(gè)體的動(dòng)員以獲得CD34+細(xì)胞的研究還未見報(bào)道。

綜上所述，G-CSF對(duì)肝硬化大鼠是一種安全有效的獲取外周血中更多CD34+細(xì)胞的方法。動(dòng)員后的外周血中骨髓/造血干細(xì)胞源性的肝干細(xì)胞，可以用于多種部位的自體移植或者在體外培養(yǎng)擴(kuò)增分化為肝細(xì)胞的研究，從而為各種終末期肝病的細(xì)胞學(xué)治療提供一種可能的細(xì)胞來(lái)源。

參考文獻(xiàn)：

[1]立野知世，吉田勝利.肝膽細(xì)胞.蛋白核酸酵素.[J] 2000，45：2085-2091