Slit/Robo信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

梁剛，馬清涌，王智翔，何盟國(guó)，鄭康，譚棟，沈乃營(yíng)

1陜西省核工業(yè)215醫(yī)院普通外二科，陜西 咸陽(yáng) 712000

2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061

神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit家族是一類分泌型糖蛋白，可通過(guò)結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞膜上的Roundabout（Robo）受體家族發(fā)揮生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號(hào)通路除了參與神經(jīng)軸突導(dǎo)向作用外，還在膿毒血癥時(shí)保護(hù)血管的完整[1]、白細(xì)胞趨化性反應(yīng)、血管生成及損傷[2-4]、心血管系統(tǒng)的形成[5]、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6-7]等方面發(fā)揮生物活性。本文就Slit/Robo信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系作一綜述。

1 Slit/Robo信號(hào)通路概述

Slit蛋白家族由Slit1、Slit2、Slit3組成，除在神經(jīng)組織中表達(dá)外，在腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、肺臟、腎臟、黃體等多種非神經(jīng)組織中也有表達(dá)。Slit結(jié)構(gòu)蛋白由1個(gè)N-末端信號(hào)肽、4個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR，即D1-D4）、7～9個(gè)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）樣的重復(fù)序列、1個(gè)半胱氨酸富有區(qū)C末端序列和1個(gè)層黏連蛋白G樣結(jié)構(gòu)域5個(gè)部分組成。其中，LRR是Slit蛋白與其受體Robo結(jié)合必需的區(qū)域。目前已有研究證實(shí)，Slit2蛋白水解后可產(chǎn)生1個(gè)N末端片段（Slit2-N）和1個(gè)C末端片段（Slit2-C）。Slit2-N端包含1個(gè)N-末端信號(hào)肽、4個(gè)LRR和5個(gè)EGF樣的重復(fù)序列，分子量為140 kD；Slit2-C端則由剩下的部分組成，分子量為55～60 kD。

Robo家族是一類保守跨膜受體蛋白，由4個(gè)成員組成，包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，也可以表達(dá)于非神經(jīng)系統(tǒng)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞等。Robo1、Robo2和Robo3由含有5個(gè)免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域樣功能區(qū)及3個(gè)Ⅲ型纖連蛋白（fibronectin typeⅢ，F(xiàn)N3）組件的胞外區(qū)、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞內(nèi)區(qū)組成。胞內(nèi)區(qū)域含有CC0、CC1、CC2、CC3四個(gè)小的區(qū)域。Robo4胞外區(qū)域只含2個(gè)Ig樣功能區(qū)以及3個(gè)Ⅲ型纖連蛋白重復(fù)序列；胞內(nèi)區(qū)域只含有CC0和CC2區(qū)域。Robo的胞內(nèi)區(qū)域通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)某些活性物質(zhì)結(jié)合，參與傳導(dǎo)生物學(xué)信息。

在Slit/Robo信號(hào)通路中，配體和受體的穩(wěn)定結(jié)合是通過(guò)Slit-N端的LRR尤其是Slit D2，與Robo胞外的Ig通過(guò)高度保守的靜電作用及非親水區(qū)域相結(jié)合。在硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）蛋白多聚糖的參與下，Slit主要通過(guò)第2個(gè)LRR（D2）和Robo胞外前兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域樣功能區(qū)（Ig1、Ig2）結(jié)合，激活Robo受體胞內(nèi)區(qū)域，使其與下游效應(yīng)物質(zhì)如 Rho GTPases、Abl、Ena、ERK1/2、Vilse等相互作用，發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)功能。需要指出的是，Robo1、Robo2、Robo3可以利用Ig1功能區(qū)與Slit2結(jié)合，而Robo4缺乏與Slit2結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

2 Slit/Robo信號(hào)在腫瘤中的表達(dá)

目前，Slit、Robo在多種腫瘤中均有表達(dá)，但其表達(dá)情況存在差異。在腫瘤表達(dá)升高方面，Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Slit2在鱗狀胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤、直腸黏液腺瘤等常見(jiàn)腫瘤中均有表達(dá)。Slit2在惡性黑色素瘤系A(chǔ)375細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而Robo1則在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，推測(cè)腫瘤細(xì)胞分泌蛋白Slit2與血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Robo1以旁分泌的方式參與惡性黑色素瘤的發(fā)生。在直腸癌腫瘤細(xì)胞中，Robo1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而Robo4和Slit2的表達(dá)無(wú)明顯變化，但Robo4基因的表達(dá)水平在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中明顯上調(diào)，因此，Robo蛋白可能成為對(duì)抗腫瘤生成及腫瘤血管產(chǎn)生的潛在治療靶點(diǎn)[9]。在乳腺癌中，Schmid等[10]檢測(cè)出Robo1呈現(xiàn)高表達(dá)，Slit2能夠誘導(dǎo)表達(dá)Robo1的腫瘤細(xì)胞發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。

在腫瘤表達(dá)下降方面，有研究顯示，Slit、Robo基因在許多惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。Slit可以通過(guò)結(jié)合其受體Robo調(diào)節(jié)多種由趨化因子誘導(dǎo)的體細(xì)胞的遷移，但是這些基因在人類的許多腫瘤中由于啟動(dòng)子的甲基化而滅活[11-13]。Narayan等[14]認(rèn)為Slit、Robo基因的修飾變化在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，Slit、Robo基因常常表現(xiàn)出高度頻繁的啟動(dòng)子甲基化，而導(dǎo)致它們?cè)谇忠u性宮頸癌中的表達(dá)量減少。但是在宮頸癌細(xì)胞系中，用DNA甲基化抑制因子和組蛋白去乙?；覆荒苡行У卦倩罨疭lit、Robo基因。在鼠類的乳腺癌細(xì)胞中，Slit或其受體Robo缺失時(shí)常常伴隨著SDF1和CXCR4的表達(dá)上調(diào)，還可出現(xiàn)周圍間質(zhì)細(xì)胞的病理性增生肥大和結(jié)締組織的增生。在乳腺癌組織中，同樣表現(xiàn)出Slit和CXCR4表達(dá)相反的情況。在異種移植動(dòng)物模型中，Slit的過(guò)表達(dá)可以下調(diào)CXCR4，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這些現(xiàn)象均表明Slit可以作為SDF1和CXCR4的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，從而參與乳腺癌的進(jìn)展過(guò)程[15]。

即使在同一個(gè)腫瘤中，Slit和Robo的表達(dá)也有差別。Avci等[16]采用基因檢測(cè)的方法，發(fā)現(xiàn)Slit和Robo基因在肝細(xì)胞系及肝癌組織中表現(xiàn)出兩種表達(dá) 模 式 ，一 種 是 Robo1、Robo2、Slit1；一 種 是Robo4、Slit2、Slit3。Robo1、Robo2表達(dá)明顯上調(diào)，但Slit3在有高甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）時(shí)表達(dá)明顯下降。與正常肝臟組織相比，Robo1在腫瘤組織中表達(dá)升高，而Robo4在腫瘤組織中表達(dá)下降。

Slit和Robo在上述組織中差異性的表達(dá)，說(shuō)明了Slit/Robo信號(hào)通路具有復(fù)雜性，這與Slit/Robo信號(hào)通路不同配體、受體之間的相互作用以及機(jī)制的不同有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

3 Slit/Robo信號(hào)對(duì)腫瘤新生血管的作用

腫瘤新生血管的形成對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移都具有很大的促進(jìn)作用。目前已發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在Robo1、Robo4兩種受體，在Slit/Robo信號(hào)通路中，它們對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用不同，進(jìn)而影響新生血管的形成。

在促進(jìn)腫瘤新生血管生成方面，Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）存在著Robo1受體，腫瘤細(xì)胞分泌的Slit2可以與其結(jié)合，吸引HUVEC向腫瘤遷移，誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。但是，應(yīng)用Robo1的細(xì)胞外片段或Robo1抗體對(duì)Slit2進(jìn)行預(yù)處理后，HUVEC則無(wú)遷移現(xiàn)象。通過(guò)阻斷Slit2/Robo1信號(hào)通路可以抑制倉(cāng)鼠頰黏膜鱗狀細(xì)胞癌動(dòng)物模型中腫瘤新生血管的形成，因此，針對(duì)Slit/Robo的靶向治療可成為口腔癌抗腫瘤新生血管生成治療的一個(gè)新方向[17]。Slit2結(jié)合Robo1可以促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成，其作用可被功能性抗體R5阻斷，因此，Yang等[18]推測(cè)Slit2是一個(gè)有潛力的淋巴血管生長(zhǎng)因子。

在抑制腫瘤新生血管形成方面，目前研究認(rèn)為，Robo4是內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因，在人微血管內(nèi)皮 細(xì) 胞（human microvascular endothelial cell，HMVEC）及HUVEC中均有表達(dá)，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的功能。Seth等[19]在黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到Robo4的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Robo4被Slit2激活后，可抑制由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移作用，而這種抑制作用是通過(guò)Ras-Raf-Mek-Erk信號(hào)通路所介導(dǎo)的。Stella等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Slit2/Robo1信號(hào)通路能夠抑制運(yùn)動(dòng)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移。通過(guò)siRNA滅活Slit2基因或使Robo基因異常表達(dá)，可以促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成，并上調(diào)細(xì)胞分裂周期蛋白Cdc42的表達(dá)和降低Rac-1的活性。而當(dāng)細(xì)胞Slit2蛋白主動(dòng)分泌增強(qiáng)或外源性加入Slit2蛋白時(shí)，可以抑制HGF觸發(fā)的細(xì)胞能動(dòng)反應(yīng)，降低Cdc42的活性，激活Rac-1。

Enomoto等[21]對(duì)Robo1、Robo4的研究發(fā)現(xiàn)，在Robo4基因敲除的情況下，Slit2可以誘導(dǎo)HUVEC遷移，而這種作用在Robo1缺失的情況下消失，說(shuō)明了Slit2/Robo1可以誘導(dǎo)血管的生成，Slit2/Robo4則負(fù)性調(diào)節(jié)血管的生成。Sheldon等[22]通過(guò)免疫共沉淀測(cè)定發(fā)現(xiàn)Robo1、Robo4可形成異二聚體，通過(guò)協(xié)同作用調(diào)節(jié)HUVEC肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，調(diào)控細(xì)胞遷移。筆者設(shè)想，Slit/Robo信號(hào)通路在腫瘤血管生成的過(guò)程中主要有Slit2/Robo1和Slit2/Robo4兩個(gè)亞通路參與，前者誘導(dǎo)腫瘤血管生成，后者的作用相反，這兩個(gè)亞通路在某一段時(shí)期會(huì)以其中一條亞通路的作用為主，與血管周圍環(huán)境保持著動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而維持血管的生成。另外，Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Slit3分泌和表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，以旁分泌或自分泌形式通過(guò)結(jié)合Robo4刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，因此，認(rèn)為Slit3是一個(gè)新型的血管生長(zhǎng)因子。

總之，Slit/Robo信號(hào)與腫瘤血管的作用及機(jī)制復(fù)雜，在不同的微環(huán)境下，Slit/Robo信號(hào)對(duì)血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用不盡相同，這個(gè)觀念也逐漸成為大家的共識(shí)。盡管Slit/Robo信號(hào)與腫瘤血管之間的很多問(wèn)題尚未解決，但是隨著研究的深入，Slit/Robo信號(hào)通路很有可能成為抗腫瘤血管治療的新靶點(diǎn)。

4 Slit/Robo信號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的作用

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移是原發(fā)性腫瘤發(fā)展為繼發(fā)性腫瘤的一個(gè)必要條件，也是腫瘤患者死亡的主要原因。Slit/Robo信號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的作用報(bào)道不一，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移方面，有研究報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，添加重組的Slit2能夠縮小腫瘤體積，應(yīng)用Robo1-Fc阻斷Slit2可使腫瘤生長(zhǎng)，并使細(xì)胞形成更具侵犯性的形態(tài)[24]。Kong等[25]發(fā)現(xiàn)表達(dá)Slit的肺癌細(xì)胞的成瘤能力及侵襲能力均降低。他們認(rèn)為，抑癌基因Slit通過(guò)結(jié)合Robo受體，進(jìn)而使Robo受體胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合肌球蛋白9（Myo9b）的RhoGAP酶，并抑制RhoGAP酶活性，從而抑制GTP-RhoA向GDP-RhoA轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致GTP-RhoA增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移及侵襲。Slit-Robo Rho GTP酶激活蛋白1（Slit-Robo GTPase-activating protein 1，srGAP1）是Slit-Robo途徑下游的關(guān)鍵GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），已有研究顯示，通過(guò)減少活化的Cdc42能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲[26]。Feng等[27]發(fā)現(xiàn)SrGAP1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)較癌旁組織下降47.5%，且與淋巴管浸潤(rùn)、腫瘤分化差、TNM分期高、生存期短有關(guān)。與Slit2結(jié)合后，Robo1胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，并促使srGAP1募集到Robo1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)減少活化的Cdc42，抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的遷移。在食管癌中，Slit2對(duì)Cdc42和細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控作用也有報(bào)道[28]。Slit/Robo信號(hào)通路還可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移[29]。

在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移方面，Zhao等[30]發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)MMP-2、MMP-9及下調(diào)E-鈣黏連蛋白，Slit2/Robo1信號(hào)通路可促進(jìn)舌癌細(xì)胞的黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移。通過(guò)在小腸癌小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，Slit2、Robo1在小腸癌中呈過(guò)表達(dá)，激活Slit2/Robo1信號(hào)通路可誘導(dǎo)小腸黏膜發(fā)生惡變，并通過(guò)活化Src信號(hào)下調(diào)E-鈣黏連蛋白，進(jìn)而激活Wnt/βcatenin 途徑，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[31]。Li等[32]發(fā)現(xiàn)Robo1、Robo4表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞中，阻斷Robo4對(duì)種植瘤的存活及生長(zhǎng)無(wú)影響，而阻斷Robo1后，種植瘤的存活量及體積明顯縮小。Schmid等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4、Robo1、Slit2均可以在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中表達(dá)，CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移作用可以被Slit2抑制，但Slit2對(duì)表達(dá)Robo1的乳腺癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的作用，并且Slit/Robo信號(hào)通路可以上調(diào)MMP-9基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。

Slit/Robo信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移中的作用目前尚無(wú)定論，甚至矛盾，例如在結(jié)腸癌中，Slit2結(jié)合Robo1受體可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[33]。而Chen等[34]認(rèn)為Slit2可通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用。Huang等[35]認(rèn)為Slit2/Robo1信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制遷移作用由泛素特異性蛋白酶33（ubiquitin specific protease 33，USP33）介導(dǎo)，并將USP33作為結(jié)腸癌的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

各方面矛盾的研究結(jié)果說(shuō)明了Slit/Robo信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及遷移作用的復(fù)雜性，這與Slit/Robo信號(hào)通路的多個(gè)受體、配體參與及其下游的多種機(jī)制調(diào)控有關(guān)，甚至在一些腫瘤中，腫瘤細(xì)胞周圍的間葉組織也可參與到該信號(hào)通路中，對(duì)腫瘤的侵襲發(fā)揮作用[36]。因此，對(duì)Slit/Robo信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)，不能孤立地僅看某一方面的作用，從多方面思考可能會(huì)加深對(duì)兩者深層次關(guān)系的認(rèn)識(shí)，從而為今后的研究提供更加廣闊的視野。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，盡管Slit/Robo信號(hào)通路對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用及機(jī)制尚未完全闡明，甚至現(xiàn)有的報(bào)道存在矛盾，但仍可看出其與腫瘤密切相關(guān)。綜合目前已有的研究或報(bào)道，筆者大膽地推測(cè)，Slit/Robo信號(hào)通路對(duì)腫瘤的作用與Slit、Robo結(jié)合的受配體及腫瘤周圍的微環(huán)境有關(guān)。不同的Slit、Robo如何結(jié)合，不同亞型的Slit/Robo信號(hào)通路對(duì)腫瘤的作用如何，對(duì)腫瘤的作用受哪些因素的影響，Slit/Robo信號(hào)通路下游機(jī)制是什么，這些復(fù)雜的問(wèn)題均有待于進(jìn)一步深入研究，從而為腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)。

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