非小細(xì)胞肺癌患者ALK表達(dá)與臨床病理特征對(duì)比分析

王 弦 李曉燦 江冬瑞 葉飛飛 吳 強(qiáng)

近年來(lái)，隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制方面的深入研究，以分子靶向診療為核心的“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念被人們所提出并應(yīng)用到臨床中，給肺癌的治療帶來(lái)了新的契機(jī)[1]。克唑替尼是針對(duì)EML4-間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)新的治療靶點(diǎn)，全球每年新發(fā)肺癌ALK突變陽(yáng)性患者約有6.8萬(wàn)人，這些患者均可從靶向治療藥物克唑替尼中獲益[2-3]。因此，開(kāi)展針對(duì)EML4-ALK融合基因的檢測(cè)具有重要的臨床意義?；诖耍瑸檠芯糠伟┗颊逧ML4-ALK融合基因的陽(yáng)性率，提高肺癌診治水平，本研究選取100例NSCLC患者為研究對(duì)象，采用CSCO腫瘤生物標(biāo)志物專家委員會(huì)專家組所推薦的全自動(dòng)免疫組化的方法檢測(cè)ALK的表達(dá)，并與患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期為相關(guān)疾病的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 抗ALK兔單克隆抗體(D5F3)、陰性質(zhì)控抗體、OptiView DAB免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)和增強(qiáng)試劑盒[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；Ventana Bench Mark XT全自動(dòng)免疫組化儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]；正電荷黏附載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.2 研究對(duì)象 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年1月至2017年10月收治的經(jīng)病理診斷確診為非小細(xì)胞肺癌的100例患者作為研究對(duì)象，所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)均依照WHO(2015年)肺腫瘤分類。患者年齡42～82歲，平均 (62.50±8.00)歲；男性59例，女性41例；48例有吸煙史，52例無(wú)吸煙史；腫瘤直徑≤5 cm的77例，腫瘤>5 cm的23例；左肺腫瘤42例，右肺腫瘤58例；腺癌84例，非腺癌16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。采集基本臨床特征資料：年齡、性別、吸煙史、腫塊直徑、發(fā)生部位、病理分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。所有數(shù)據(jù)采集均征得患者同意并簽署知情同意書。

1.3 方法 所有標(biāo)本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，制作石蠟標(biāo)本后進(jìn)行組織切片，切片厚度為4 μm，分成陰性質(zhì)控片組和檢測(cè)片組。其中，在檢測(cè)片組撈取1個(gè)正常闌尾切片作為陽(yáng)性對(duì)照組。按照羅氏公司ALK蛋白檢測(cè)說(shuō)明流程上機(jī)檢測(cè)。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn) 采用二元判讀法，根據(jù)是否存在二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)信號(hào)，每位患者均同時(shí)判讀ALK抗體檢測(cè)片和相應(yīng)的陰性質(zhì)控片。陰性質(zhì)控片評(píng)估非特異的背景染色和已知會(huì)因特定組織成分而染色的背景染色強(qiáng)度；ALK(D5F3)抗體檢測(cè)片上正常闌尾的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞DAB顯色作為陽(yáng)性對(duì)照，幫助判斷此張切片染色是否成功；待檢組織腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性為腫瘤細(xì)胞中存在很強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色(任何百分比的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)；陰性為腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀胞漿染色。其中，診斷為陽(yáng)性時(shí)需排除已知的染色元素，包括：肺泡巨噬細(xì)胞中較淡的胞漿點(diǎn)彩；神經(jīng)來(lái)源的細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)；腺狀上皮染色，以及淋巴細(xì)胞性浸潤(rùn)中的細(xì)胞。另外，NSCLC患者正常黏膜(包括黏蛋白)內(nèi)以及壞死組織區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)一些背景染色也應(yīng)從臨床評(píng)估中排除。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALK在NSCLC患者中的表達(dá) ALK陽(yáng)性可見(jiàn)很強(qiáng)的顆粒狀棕黃色胞漿染色，主要表達(dá)定位于肺癌組織的細(xì)胞質(zhì)；ALK陰性未見(jiàn)任何顆粒性棕黃色陽(yáng)性信號(hào)；陽(yáng)性對(duì)照組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。100例NSCLC患者中，有6例ALK陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為6.00%。

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者ALK表達(dá)比較 不同年齡區(qū)間患者的ALK陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同腫塊直徑間患者的ALK陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同病理分型間患者的ALK陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而不同性別、是否吸煙、發(fā)生部位以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間患者的ALK陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界危害人類健康最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率近年呈逐年升高的態(tài)勢(shì)，其病死率已躍居首位，且5年生存率較低[4-5]。我國(guó)是肺癌的高發(fā)國(guó)家之一，發(fā)病率及病死率都高于世界平均水平。NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌和類癌等。傳統(tǒng)的一線化療藥物鉑類在肺癌的治療中一直處于主導(dǎo)地位，但由于傳統(tǒng)的化療藥物缺乏組織特異性，且長(zhǎng)期用藥對(duì)患者身體帶來(lái)非常大的副作用，是肺癌治療方面多年來(lái)所面臨的難題之一[6-7]。

ALK是一種由人類ALK基因編碼的酶，又被稱為酪氨酸激酶受體或CD246，是胰島素受體超家族成員之一[8]。ALK在大腦的發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色，由于其編碼的酪氨酸激酶只在一定的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，因此只對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中的特定神經(jīng)元產(chǎn)生影響。作為一種新的受體酪氨酸激酶，ALK基因在細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其異常表達(dá)時(shí)常通過(guò)擴(kuò)增、突變和形成融合基因等方式產(chǎn)生強(qiáng)致癌驅(qū)動(dòng)基因，從而導(dǎo)致肺癌、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤的產(chǎn)生[9]。1994年，Morris等[8]發(fā)現(xiàn)ALK以NPM-ALK融合蛋白的形式存在于間變性大細(xì)胞淋巴瘤；2007年，Soda等[10]發(fā)現(xiàn)EML4與ALK基因在約6.7%的NSCLC患者中發(fā)生融合突變。EML4-ALK融合基因由第2號(hào)染色體插入形成，其編碼的蛋白產(chǎn)物可導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶持續(xù)高表達(dá)，從而激活下游的PI3K-AKT、MAPK及JAK-STAT等信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，在NSCLC中發(fā)揮重要的驅(qū)動(dòng)作用，被認(rèn)為是NSCLC新興的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，對(duì)肺癌的臨床診療具有十分重要的生物學(xué)意義。

克唑替尼作為ALK融合基因的小分子靶向藥物，在臨床治療中顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。因此，準(zhǔn)確地檢測(cè)ALK并研究總結(jié)其臨床病理特征顯得尤為重要。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，4981例NSCLC患者中有405例ALK表達(dá)陽(yáng)性，其預(yù)后明顯好于ALK陰性患者，且患者的吸煙狀況也影響ALK基因相關(guān)的NSCLC患者的預(yù)后。Inamura等[12]發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因主要存在于輕度吸煙者(每年少于10包)或不吸煙的的腺癌患者中，并且與表皮生長(zhǎng)因子受體或鼠類肉瘤病毒癌基因突變無(wú)關(guān)。Dai等[13]研究表明對(duì)ALK陽(yáng)性的NSCLC患者使用ALK抑制劑可能會(huì)增加放療的局部控制效果，針對(duì)晚期的NSCLC患者在放療之前進(jìn)行ALK檢測(cè)，繼而通過(guò)聯(lián)合ALK抑制劑和放療，從而為臨床提供一種毒性較低的治療方案。

本研究采用全自動(dòng)免疫組化法檢測(cè)了100例NSCLC患者的ALK蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ALK主要表達(dá)定位于肺癌的細(xì)胞質(zhì)中，且NSCLC患者的ALK陽(yáng)性表達(dá)率為6.00%，與黃曉琳等[14]研究(3%～8%)數(shù)據(jù)一致。分析發(fā)現(xiàn)，ALK陽(yáng)性患者41～60歲人群的占比較高；女性和不吸煙者占優(yōu)勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ALK陽(yáng)性患者組織學(xué)類型以腺癌為主，且腫瘤直徑以≤5 cm居多，但腫瘤的發(fā)病部位沒(méi)有顯著特征；另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于ALK陰性患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[14-16]，ALK陽(yáng)性患者以年輕、女性、不吸煙及腺癌為主要特征，本研究顯示出同樣的結(jié)果。然而本研究將不同性別、吸煙史、發(fā)生部位以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間患者ALK陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能由于本研究的病例數(shù)較少，從而導(dǎo)致陽(yáng)性樣本偏少引起的偏差。另外，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑可能成為ALK陽(yáng)性患者的潛在特征，下一步研究中將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)，有望為NSCLC的臨床診療提供新的理論依據(jù)和參考。