白羽肉雞胸腿肉的氧化對(duì)食用品質(zhì)和鈣蛋白酶活性的影響

鄧凱波，黃雅萍，許正金，傅靈韻，鄭寶東,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國(guó)愛爾蘭國(guó)際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心，福建 福州 350002；3.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；4.福建正大食品有限公司，福建 龍巖 364000）

白羽肉雞是我國(guó)肉雞產(chǎn)品的重要組成部分，也是肉雞屠宰加工企業(yè)的主要原料。因其具有高蛋白、低膽固醇、低脂肪和低熱量等特點(diǎn)，已成為世界各地消費(fèi)者普遍接受的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源。但在規(guī)模化屠宰加工過(guò)程中，白羽肉雞的保水性和質(zhì)構(gòu)特性（彈性、咀嚼性、凝聚性等）相比其他肉類還有待提高[1]，這制約著我國(guó)白羽肉雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。目前已有研究表明，豬、牛等大型動(dòng)物的肌肉汁液損失與氧化應(yīng)激有關(guān)[3]，但氧化應(yīng)激在禽肉中研究較少。

在肉類加工和貯存過(guò)程中，溫度、光、射線、氧等外界環(huán)境均會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)生氧化，主要引起水、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等宏量營(yíng)養(yǎng)素的水平變化[4-5]。研究表明，持水性與宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解有關(guān)[6]，而蛋白質(zhì)氧化是發(fā)生在脂類氧化之后的第二階段反應(yīng)[7]，主要為活性氧物質(zhì)（如羥自由基、肌紅蛋白自由基或脂類次級(jí)氧化產(chǎn)物等）引起的如肽鍵斷裂、側(cè)鏈修飾、蛋白質(zhì)分子間共價(jià)交聯(lián)（如二硫鍵）以及組氨酸（His）殘基轉(zhuǎn)變等一系列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[8]，從而導(dǎo)致包括骨架蛋白、抗萎縮蛋白和整合蛋白等的肌肉蛋白質(zhì)降解，造成蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，形成水分轉(zhuǎn)移通道，導(dǎo)致汁液流失、肌肉嫩度變差[9-10]，并進(jìn)一步影響肌肉中脂類及相關(guān)活性酶的水平。而肌肉中的不易流動(dòng)水則會(huì)在肌肉僵直和成熟過(guò)程中，隨著肌肉結(jié)構(gòu)和pH值的變化而變化，這也是汁液損失的主要原因[11]。

由于肌肉持水性能與嫩度密切相關(guān)[12]。作為參與肉質(zhì)嫩化的主要酶系，鈣蛋白酶I（μ-calpain）和鈣蛋白酶II（m-calpain）表達(dá)量的上調(diào)會(huì)使肌肉蛋白發(fā)生水解導(dǎo)致肉質(zhì)嫩度增加，表明鈣蛋白酶的水解作用是導(dǎo)致肉質(zhì)嫩化的主要因素。因此鈣蛋白酶在肌肉中的濃度是肉類嫩度的一個(gè)重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[13]。而在氧化應(yīng)激條件下，肌肉纖維蛋白及活性酶均發(fā)生不同程度的氧化變性和活性下降?，F(xiàn)有蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激方面的研究主要集中在豬和牛等大型哺乳類動(dòng)物[14-15]，家禽方面報(bào)道較少。因此，研究白羽肉雞的持水性影響因素對(duì)于研究禽類肌肉汁液損失的控制手段和提高我國(guó)白羽肉雞企業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

本研究從高、低兩個(gè)氧化水平出發(fā)，探討氧化對(duì)白羽肉雞不同部位肌肉持水性能的影響，及其對(duì)肌肉蛋白質(zhì)和脂類營(yíng)養(yǎng)素氧化程度的作用；并研究氧化條件下肌肉鈣蛋白酶水平變化及與持水能力的相關(guān)性，以期為解決白羽肉雞產(chǎn)業(yè)中氧化控制問(wèn)題提供理論支持，并為企業(yè)降低經(jīng)濟(jì)損失和提高產(chǎn)品價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼養(yǎng)管理相同的6 周齡或體質(zhì)量2.0～2.5 kg的AA白羽肉雞6 只 福建正大食品有限公司；三羥甲基氨基甲烷鹽-酸鹽（tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl，Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙酸、β-巰基乙醇、KCl、CaCl2和酪蛋白等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；BT125D電子分析天平、pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；DHG-9075A數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器、HWS-26水浴鍋上海一恒科技有限公司；HG04-TP101型食品中心溫度計(jì)北京北信未來(lái)電子儀器有限公司；JY92-II型超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物工程有限公司；UV-2601型紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；DS-1型組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

以白羽肉雞胸肉和腿肉為研究對(duì)象，在宰后24 h內(nèi)分離、單獨(dú)冷凍并分裝，于-20 ℃冷庫(kù)中存放。使用時(shí)，隨機(jī)選取分裝樣品并置于4 ℃中至自然解凍后，分別割取中心部位質(zhì)量約為100 g肉塊進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 樣品氧化處理

參考劉澤龍[16]關(guān)于肉氧化處理的方法，并做適當(dāng)改動(dòng)。取上述肌肉樣品12 塊，用紙巾吸干表面水分后，每4 塊為一組，分別置于3 組不同水平的Fenton氧化體系（FeCl3/抗壞血酸/H2O2）中，模擬肌肉氧化，溶液成分如下：

低氧化水平體系：15 mmol/L哌嗪-1,4-二乙磺酸（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）緩沖液，1、5、10、20 mmol/L H2O2，0.1 mmol/L抗壞血酸，0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時(shí)間為1 h。

高氧化水平體系：15 mmol/L PIPES緩沖液，20、30、40、50 mmol/L H2O2，0.1 mmol/L抗壞血酸，0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時(shí)間為5 min。

空白對(duì)照：15 mmol/L PIPES緩沖液，0.1 mol/L NaCl，pH 6.2，氧化時(shí)間為1 h和5 min。

氧化反應(yīng)的終止：在體系中加入終濃度為1 mmol/L的EDTA終止氧化，反應(yīng)時(shí)間5 min。氧化反應(yīng)終止后立即將樣品取出，靜置瀝水5 min后，立即進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 肌肉持水力的測(cè)定

隨機(jī)取樣（精確記質(zhì)量m0/g）置于底部墊有紗布的50 mL離心管中，在2 000×g、4 ℃下離心20 min后記質(zhì)量（m1/g），之后將離心后的樣品置于烘箱中，在105 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，測(cè)定除去水分后的肌肉質(zhì)量（m2/g）。持水力由公式（1）計(jì)算。

1.3.4 蒸煮損失率的測(cè)定

隨機(jī)取一定質(zhì)量（m1/g）肌肉樣品置于80 ℃恒溫水浴中加熱，當(dāng)樣品中心溫度達(dá)60 ℃立即取出，流水冷卻至室溫，吸干樣品表面汁液后稱質(zhì)量（m2/g）。每次測(cè)定3 個(gè)重復(fù)。蒸煮損失率計(jì)算見公式（2）。

1.3.5 產(chǎn)品得率的測(cè)定

方法同1.3.4節(jié)測(cè)定蒸煮損失率，產(chǎn)品得率計(jì)算見公式（3）。

1.3.6 蛋白質(zhì)氧化水平的測(cè)定

因氧化后的肌肉蛋白會(huì)因氧化型自由基的攻擊而發(fā)生羰基化現(xiàn)象，故蛋白質(zhì)羰基化可作為衡量氧化程度的指標(biāo)之一，因此采用2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）法測(cè)定[17]。樣品蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測(cè)定[18]。

1.3.7 脂質(zhì)過(guò)氧化水平的測(cè)定

參照孟少華等[19]所述方法：將10 g氧化后待測(cè)樣品和對(duì)照樣分別研細(xì)，加50 mL含0.1 g/100 mL EDTA的體積分?jǐn)?shù)7.5%三氯乙酸溶液，振搖30 min后雙層濾紙過(guò)濾2 次。取5 mL濾液，加入5 mL 0.02 mol/L的1,2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，沸水浴中保溫40 min，取出冷卻1 h后，以1 600 r/min離心5 min，取上清液加5 mL氯仿?lián)u勻，靜置分層后吸取上清液，分別在532 nm和600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用公式（4）計(jì)算硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，單位以每千克肉中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的質(zhì)量來(lái)表示。

1.3.8 鈣蛋白酶活力的測(cè)定

白羽肉雞胸肉的鈣蛋白酶粗酶液的提取和活力測(cè)定參照謝婷[20]所述方法進(jìn)行，其中鈣蛋白酶的活力以每克肌肉樣品中的酶活力來(lái)表示，即在25 ℃下水解酪蛋白1 h可使278 nm波長(zhǎng)處吸光度增加1.0所需的酶量，用公式（5）計(jì)算鈣蛋白酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每項(xiàng)指標(biāo)均進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，并設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化對(duì)雞肉持水力水平的影響

圖1 氧化應(yīng)激對(duì)雞胸肉和腿肉持水力水平的影響Fig.1 Effect of oxidation treatment on water-holding capacity of broiler breast and drumstick meat

由圖1可知，與對(duì)照組相比，胸肉和腿肉的處理組持水力均有不同程度降低。10 mmol/L和20 mmol/L H2O2處理1 h，以及50 mmol/L H2O2處理5 min后，持水力均顯著下降（P＜0.05），且兩組氧化濃度處理的持水力變化趨勢(shì)相似。說(shuō)明氧化使肌肉組織內(nèi)部原本穩(wěn)定其水分的能力遭到破壞，這可能與肌原纖維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)。

肌肉中大部分水分存在于肌原纖維及肌球蛋白粗纖絲和肌動(dòng)蛋白/原肌球蛋白細(xì)纖絲之間的間隙中，肌原纖維間隙中的水分構(gòu)成了汁液流失的主要組成部分[21]。氧化可造成肌原纖維蛋白質(zhì)表面的疏水性殘基暴露，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、蛋白交聯(lián)程度發(fā)生改變，從而導(dǎo)致肌纖維之間間距的改變，造成肌原纖維間的空間內(nèi)原有水分的流失[22-23]。

2.2 氧化對(duì)雞肉蒸煮損失率和產(chǎn)品得率的影響

圖2 氧化應(yīng)激條件對(duì)雞胸肉和腿肉蒸煮損失和產(chǎn)品得率的影響Fig.2 Effect of oxidation treatment on cooking loss and yield of broiler breast and drumstick meat

由圖2可知，隨著H2O2濃度的升高，各處理組蒸煮損失率逐漸增大，產(chǎn)品得率逐漸降低，這同樣與氧化造成的肌原纖維蛋白質(zhì)變化有關(guān)[23]。

此外，與腿肉結(jié)果相比，胸肉蒸煮損失率較小，說(shuō)明水浴加熱后胸部肌肉組織的內(nèi)部水分含量更高，這可使其嫩度更高、口感更好，各處理組的胸肉得率也遠(yuǎn)高于相同條件下的腿肉得率。這是由于兩個(gè)部位肌肉在來(lái)源、肌纖維類型和蛋白組成等方面存在差異[24]，其中胸部肌肉蛋白質(zhì)凝膠能力更強(qiáng)，受熱前較長(zhǎng)的肌纖維形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使其聚集能力更強(qiáng)[25]；因此具有更好的受熱保水能力，嫩度更高。這也與消費(fèi)者對(duì)于胸肉相對(duì)較嫩、腿肉相對(duì)較柴的習(xí)慣感官經(jīng)驗(yàn)相一致。

2.3 氧化對(duì)肌肉蛋白羰基水平的影響

蛋白羰基水平是蛋白氧化的標(biāo)志之一。由圖3可知，H2O2濃度與蛋白羰基濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，即隨著氧化程度的加深，肌肉蛋白質(zhì)羰基化程度越高。但與低濃度H2O2長(zhǎng)時(shí)氧化處理相比，高濃度H2O2短時(shí)氧化處理對(duì)肌肉蛋白羰基濃度的影響更為顯著（P＜0.05）。說(shuō)明在此條件下，H2O2濃度對(duì)蛋白羰基生成速率的影響更加顯著。同時(shí)，將雞胸肉用20 mmol/L H2O2分別氧化處理5 min和60 min，蛋白羰基濃度分別為0.85 nmol/g和1.24 nmol/g。說(shuō)明在此H2O2濃度下，延長(zhǎng)氧化時(shí)間會(huì)提高樣品中蛋白羰基含量。而在同一氧化水平下，雞胸肉和腿肉的蛋白羰基水平基本相同，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

肉雞在屠宰、加工和貯存期間，肌原纖維蛋白易受氧化，特別是蛋白質(zhì)氧化和脂類氧化，從而引起氨基酸被破壞、肽鍵斷裂、蛋白交聯(lián)等，并會(huì)生成蛋白-脂類氧化產(chǎn)物等復(fù)合物[26]，這會(huì)直接影響到肌肉持水性能，影響肉雞食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益[16]。已有研究證明，總蛋白羰基水平與牛肉的剪切力顯著相關(guān)[27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，白羽肉雞胸腿肉的蒸煮損失率與蛋白羰基水平均隨H2O2濃度升高而增加。蛋白氧化可降低牛肉的嫩度，但蛋白羰基水平與白羽雞肉嫩度之間的確切機(jī)制尚不明確[26]。

2.4 氧化對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

不同氧化處理對(duì)白羽肉雞胸肉和腿肉的脂類氧化情況如圖4所示。在相同氧化條件下，白羽肉雞的胸肉和腿肉脂質(zhì)過(guò)氧化水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），而TBARS值隨H2O2濃度升高而增加，各處理組的TBARS值與對(duì)照組相比均有顯著升高（P＜0.05）。這是由于肉類在氧化過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧簇可以與肌細(xì)胞中的多不飽和脂肪酸和核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成如MDA的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，故本研究中不同的H2O2濃度使肌肉的脂質(zhì)過(guò)氧化程度產(chǎn)生差異。

但在不同氧化時(shí)間的處理組（1 h和5 min）中，與高濃度H2O2短時(shí)氧化處理相比，低濃度H2O2長(zhǎng)時(shí)氧化處理對(duì)肌肉的影響更為顯著（P＜0.05）。前者的TBARS值明顯隨H2O2濃度的增加而上升（P＜0.05）；而后者生成的TBARS值較前者有所下降但仍與H2O2的濃度呈正相關(guān)。由于醛類等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物是蛋白羰基化反應(yīng)的底物之一[28]，所以高濃度氧化處理可能導(dǎo)致其因底物消耗而導(dǎo)致MDA的正向合成速度加快；同時(shí)也與高H2O2濃度條件下蛋白羰基水平較高的結(jié)果相一致（圖3B）。此外，雞胸肉經(jīng)20 mmol/L H2O2氧化處理5 min后的TBARS值為0.53 mg/kg，而氧化處理1 h后的TBARS值升至1.14 mg/kg，可見在該時(shí)間范圍內(nèi)，氧化時(shí)間越長(zhǎng)，脂質(zhì)過(guò)氧化程度越深。

2.5 氧化對(duì)肌肉鈣蛋白酶活力的影響

鈣蛋白酶是影響白羽肉雞肌肉品質(zhì)的特征性酶系，直接關(guān)系到持水性能和嫩度等指標(biāo)。有研究表明，宰后雞胸、腿肉的總鈣蛋白酶水平無(wú)顯著差異[29]，且胸肉因其更穩(wěn)定的凝膠特性[25]，為研究食用品質(zhì)的特征性部位之一，故采用胸肉進(jìn)行鈣蛋白酶的氧化研究。

圖5 不同氧化處理對(duì)肌肉鈣蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of oxidation treatment on calpain activity of broiler breast and drumstick meat

不同氧化條件對(duì)雞胸肉鈣蛋白酶活性影響如圖5所示。經(jīng)過(guò)兩種不同濃度的氧化處理，發(fā)現(xiàn)在氧化體系中鈣蛋白酶活力均隨H2O2濃度升高而逐漸降低。所有氧化濃度的鈣蛋白酶活力均與對(duì)照組具有顯著差異（P＜0.05），且相隔處理組的酶活力均具有極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明活性氧對(duì)鈣蛋白酶活力具有非常大的影響。且相同H2O2濃度（20 mmol/L）下，鈣蛋白酶活力也隨氧化時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低。

肉類屠宰后成熟階段，鈣蛋白酶被激活，降解細(xì)胞骨架蛋白，肌纖維收縮時(shí)產(chǎn)生的交聯(lián)及肌原纖維之間的交聯(lián)斷裂，使胞內(nèi)重新獲得水分貯存的彈性空間，持水力提高。Huff-Lonergan等[30]指出，豬肉的氧化會(huì)抑制鈣蛋白酶的活力。這與雞胸肉處理組較對(duì)照組的鈣蛋白酶活力顯著降低的結(jié)果相一致（P＜0.05）。其原因可能是因?yàn)殁}蛋白酶的活性位點(diǎn)含有His和Cys殘基，易因自由基的供給而活性降低甚至失活[9]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶可造成肌原纖維蛋白質(zhì)發(fā)生降解，將導(dǎo)致組織完整性喪失，嫩度提高[20,31]。而在氧化環(huán)境中，肌原纖維的皺縮作用直接導(dǎo)致外層連接的細(xì)胞膜同時(shí)收縮，從而使間隙中的水分因無(wú)法貯存而流失，這與本研究中氧化對(duì)持水性能研究結(jié)果相對(duì)應(yīng)，推測(cè)白羽肉雞中鈣蛋白酶的酶活力水平與白羽肉雞肉質(zhì)改變的關(guān)系密切。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同氧化應(yīng)激水平下白羽肉雞胸腿肉的持水性能、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度等食用品質(zhì)及鈣蛋白酶活力變化進(jìn)行了研究與分析，得到以下結(jié)論：氧化可造成肉雞胸肉和腿肉持水力下降，蒸煮損失率增加，產(chǎn)品得率降低，且隨著H2O2濃度升高，胸腿肉的持水性能顯著下降（P＜0.05）。其中，與胸肉相比，腿肉的蒸煮損失率和產(chǎn)品得率受氧化應(yīng)激的影響更大，主要可能是由胸肉和腿肉的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)差異所致。同時(shí)，氧化還導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素發(fā)生明顯過(guò)氧化現(xiàn)象，H2O2高濃度短時(shí)處理比低濃度長(zhǎng)時(shí)處理對(duì)肌肉蛋白羰基水平的影響更為顯著，而對(duì)TBARS值影響恰好相反。但相同條件下，胸肉與腿肉之間結(jié)果差異并不顯著（P＞0.05）。氧化對(duì)肌肉鈣蛋白酶活力具有非常大的影響，其酶活力水平隨H2O2濃度升高而逐漸降低，從而推測(cè)鈣蛋白酶活力水平與白羽雞肉肉質(zhì)改變的關(guān)系密切。這說(shuō)明在白羽肉雞的加工、貯藏中要避免其受到氧化影響，加強(qiáng)氧化抑制機(jī)制的研究。目前，在對(duì)氧化與肌肉持水能力的研究中，主要集中在肌原纖維蛋白功能變化和蛋白水解酶活力（如鈣蛋白酶等）等方面，其他影響因素還有待深入研究。