真空冷凍干燥法制備微生態(tài)制劑及其對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

■高堂亮 沈思軍 潘曉亮王新峰

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆牧區(qū)肉牛生產(chǎn)充分利用天然的草場優(yōu)勢，夏秋季節(jié)多采用放牧方式，而春冬季節(jié)轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物秸稈、農(nóng)副產(chǎn)品豐富的農(nóng)耕區(qū)飼養(yǎng)，卻使肉牛瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變[1]，而據(jù)趙晨旭[2]、Douglas LC 等[3]和Ye G等[4-5]研究報(bào)道表明，微生態(tài)制劑具有瘤胃調(diào)控作用，因此本研究以地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifor?mis，BL）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）和植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum，LP）為主要菌種，采用真空冷凍法，期待研制出一種活菌高、質(zhì)量穩(wěn)定的微生態(tài)制劑，調(diào)節(jié)肉牛胃腸道平衡、促進(jìn)瘤胃微生物的健康生長和幫助建立正常的瘤胃微生物菌群等，以期在農(nóng)耕區(qū)的肉牛能夠快速適應(yīng)環(huán)境并提高養(yǎng)分表觀消化率展開相關(guān)試驗(yàn)，為微生態(tài)制劑在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

BS和LP，均來源于石河子大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，BL購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

丙三醇(甘油)、氯化鈉(化學(xué)純)、碳酸鈣、葡萄糖、無水硫酸銅等均購自于新疆沃德生物科技公司。

BS和BL用培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)，準(zhǔn)確稱取18 g，加熱溶解于1 000 ml蒸餾水中，分裝后121℃，高壓滅菌15 min，備用；營養(yǎng)瓊脂(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)，準(zhǔn)確稱取33 g，加熱溶解于1 000 ml蒸餾水中，分裝后121℃，高壓滅菌15 min，無菌操作傾倒平板，凝固后放冰箱冷藏備用；LP用培養(yǎng)基：MRS肉湯(購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司),準(zhǔn)確稱取52.4 g，加熱溶解于1 000 ml蒸餾水中，分裝后115℃，高壓滅菌15 min，備用；MRS瓊脂(購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司),準(zhǔn)確稱取66.2 g，加熱溶解于1 000 ml蒸餾水中，分裝后115℃，高壓滅菌15 min，無菌操作傾倒平板，凝固后放冰箱冷藏備用。

1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平(AL204)、冰箱(BCD-256KF)、Thermo超低溫冰箱、高壓滅菌鍋(MLS-3750)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9246MBE)、數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204)、超凈工作臺(SW-CJ-IFD)、數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082)、數(shù)顯恒溫振蕩培養(yǎng)箱(LRH-250-A)、Thermo高速冷凍離心機(jī)、液氮罐與TELSTAR真空冷凍干燥機(jī)(LYOQUEST-85)、722型可見光分光光度計(jì)、菌落計(jì)數(shù)器(XK97-A)、FOSS自動凱氏定氮儀、索氏提取器、茂福爐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生態(tài)制劑制備方法

采用真空冷凍干燥法制備。按菌種活化、傳代、擴(kuò)繁和菌液的濃縮、預(yù)凍等處理后真空冷凍干燥及活菌數(shù)檢測等主要制備步驟進(jìn)行。

1.3.1.1 菌種活化、傳代和種子液制備

菌種活化和傳代：從-80℃冰箱中分別取出一管BS、LP和 BL菌種，室溫下解凍后，在無菌操作臺中，用酒精棉球擦拭手指和試管口處，用滅過菌的接種環(huán)分別挑取一環(huán)BS和BL接種到裝有營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿中，LP接種到MRS瓊脂的培養(yǎng)皿中，貼上封口膜，標(biāo)記上菌種名稱和日期。然后把BS和BL培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，LP培養(yǎng)皿倒置后，放在35℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 h，取出后，再分別挑取一環(huán)長勢較好的菌，傳代2～3次，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

種子液制備：在活化后BS和BL中，分別挑取一環(huán)接種到裝有10 ml營養(yǎng)肉湯的三角瓶，LP接種到10 ml MRS肉湯的三角瓶中，封口后BS和BL放置在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，200 r/min過夜培養(yǎng)20 h，LP放在35℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，160 r/min過夜培養(yǎng)16 h，取出后，即可獲得BS、BL和LP種子液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 二級菌液的制備、預(yù)處理和真空冷凍干燥

二級菌液的制備：用移液槍分別吸取8 ml BS和BL種子液，按8%的接種量接種到裝有100 ml營養(yǎng)肉湯的三角瓶中，37℃、200 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)24 h；吸取6 ml LP種子液，以6%接種量接種到裝有100 ml MRS肉湯的三角瓶中，35℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)20 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二級菌液的預(yù)處理及真空冷凍干燥：BS、BL和LP二級菌液在4 500 r/min下，4℃離心10 min，去掉上清液，獲得BS、BL和LP菌體。分別添加無菌的麩皮、葡萄糖、碳酸鈣等保護(hù)劑混合后，-196℃液氮罐中預(yù)凍2～3 min；在0.01 mbar的真空壓力下，-85 ℃真空冷凍10～20 h，即可制成BS、BL和LP凍干菌粉。

活菌數(shù)檢測及產(chǎn)品制備：

①BS計(jì)數(shù)：無菌操作準(zhǔn)確稱取BS凍干菌粉1 g，加入9 ml滅菌生理鹽水中，振蕩混勻，為10-1倍稀釋，再取10-1倍稀釋液1 ml加入9 ml滅菌生理鹽水中混勻，為10-2倍稀釋，依次稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，然后用移液槍分別吸取10-7、10-8、10-9三個(gè)稀釋度的菌液1 ml到培養(yǎng)皿中，再倒入50℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，輕輕滑動培養(yǎng)皿使得菌液和培養(yǎng)基混合均勻，每個(gè)稀釋度設(shè)置三個(gè)重復(fù)，凝固后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)公式:

BS活菌數(shù)(CFU/g)=菌落數(shù)的平均值×稀釋度

②BL計(jì)數(shù)方法同BS。

③LP計(jì)數(shù)：無菌操作準(zhǔn)確稱取LP凍干菌粉1 g，加入9 ml滅菌生理鹽水中，振蕩混勻，為10-1倍稀釋，再取10-1倍稀釋液1 ml加入9 ml滅菌生理鹽水中混勻，為10-2倍稀釋，依次稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，然后用移液槍分別吸取 10-7、10-8、10-9三個(gè)稀釋度的菌液10 μl，點(diǎn)種到裝有MRS瓊脂的培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度設(shè)置三個(gè)重復(fù)，干燥后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)20 h，觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)公式:

LP活菌數(shù)(CFU/g)=菌落數(shù)的平均值×稀釋度×100

④微生態(tài)制劑產(chǎn)品的制備：將凍干計(jì)數(shù)的BS、BL和LP按照2∶2∶1的比例混合均勻，密封包裝后，放置在低溫干燥處，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 表觀消化率測定方法

1.3.2.1 試驗(yàn)動物及飼糧

在新疆皇牛畜產(chǎn)品發(fā)展有限公司肉牛場隨機(jī)選取健康、月齡和體重[(284.9±19.33)kg]相近的本地土牛和伊犁褐牛雜交代公肉牛20頭。飼糧為全混合日糧(TMR)，其組成及營養(yǎng)水平見表1，精料補(bǔ)充料見表2。

表1 TMR組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))(%)

表2 精料補(bǔ)充料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))(%)

1.3.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

按照日齡和體重（284.9±19.33）kg相近的原則，試驗(yàn)將20頭公肉牛，隨機(jī)分對照組(CG)和試驗(yàn)組(TG)，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭，組間初始體重差異不顯著。CG飼喂TMR；TG在TMR添加微生態(tài)制劑（主要復(fù)合菌比例為BL∶BS∶LP=2∶2∶1），晨飼時(shí)與少量的TMR均勻混合后單槽飼喂，每天一次，一次性喂完，保證每頭牛食入益生菌總數(shù)為5×1010CFU/(頭·d)。預(yù)試期7 d,正試期30 d。

試驗(yàn)肉牛均栓系飼養(yǎng)，自由采食，每天05:30、12:30和19:30各飲水1次。試驗(yàn)條件下，微生態(tài)制劑必須每日飼喂，試驗(yàn)從2017年6月25日到2017年7月31日在新疆皇牛畜產(chǎn)品發(fā)展有限公司肉牛場進(jìn)行。

1.3.2.3 飼糧和糞便樣品采集與測定

在試驗(yàn)期內(nèi)，根據(jù)國標(biāo)法(GB/T 14699.1—2005)中《飼料采樣法》采集飼糧(精料補(bǔ)充料單獨(dú)采集)粉碎后樣品800 g，按“四分法”減少到200 g，共采集5 d，分裝于樣品袋中，標(biāo)注樣品信息，保存于-20℃冰箱中，待5 d樣品采集一起混合，晾干制樣，常溫保存待測；

正試期內(nèi)最后5 d，連續(xù)收集5 d的糞樣，每組收集4頭，每頭不少于200 g，加入10%稀鹽酸進(jìn)行固氮，-20℃保存。試驗(yàn)結(jié)束后，將糞樣混合均勻，65℃烘干至恒重，粉碎后過40目篩，待測。

用內(nèi)源指示劑[鹽酸不溶灰分(AIA)]法測定飼糧各養(yǎng)分的消化率。飼糧和糞便中干物質(zhì)(DM)含量參照GB/T6435—2006方法測定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量使用FOSS-2300自動凱氏定氮儀測定，粗脂肪(EE)含量采用索氏提取法測定，中性洗滌纖維(NDF)含量采用GB/T20806—2006方法測定，酸性洗滌纖維(ADF)含量采用NY/T1459—2007法測定，鹽酸不溶灰分(AIA)參照GB/T 23742—2009/ISO 5985:2002。養(yǎng)分表觀消化率計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，其中P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 真空冷凍干燥法制備微生態(tài)制劑(見表3)

由表3可知，真空冷凍干燥法制備BS、LP和BL菌粉的活菌量≥1.35×1010CFU/g，且顯著高于原菌液的活菌量(P＜0.05)。

2.2 微生態(tài)制劑對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響(見表4)

由表4可知，TG的DM、CP、EE、NDF和ADF表觀消化率均高于CG，且DM的表觀消化率顯著高于CG(P＜0.05)。

表4 微生態(tài)制劑對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響(%)

3 討論

3.1 真空冷凍干燥法制備微生態(tài)制劑

活菌含量的高低是評定微生態(tài)制劑質(zhì)量的關(guān)鍵因素，而目前真空干燥、噴霧干燥和真空冷凍干燥制備方法中，真空冷凍干燥因干燥后物質(zhì)體積、形狀基本不變，無干縮且能除去物質(zhì)中95%～99%的水分，有利于長時(shí)間保存等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。凍干法原理是將物質(zhì)中的水分凍結(jié)成冰后，在真空下使冰晶直接升華而達(dá)到干燥的目的[6]。山麗杰[7]研究發(fā)現(xiàn)，利用真空冷凍干燥技術(shù)制成的酸奶發(fā)酵劑凍干粉，活菌量≥1×1010CFU/g，崔樹茂[8]和王昕悅[9]研究都驗(yàn)證了這一結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，采用真空冷凍干燥法制成的BS、BL和LP凍干粉，活菌量≥1.35×1010CFU/g。

3.2 微生態(tài)制劑對肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

通過接種有益微生物除了建立正常微生物區(qū)系來調(diào)節(jié)胃腸道平衡和維持機(jī)體健康[10-11]外，LP具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸功能和芽孢桿菌具有蛋白酶、淀粉酶、細(xì)胞壁裂解酶、透明質(zhì)酸酶、β-1,2葡萄糖苷水解酶和半纖維素酶等酶活功能[12-13]，不僅為機(jī)體提供營養(yǎng)，還能提高養(yǎng)分的消化率[14-15]。Qiao等[16]使用地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物飼喂荷斯坦奶牛，顯著增加了瘤胃內(nèi)中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和有機(jī)物質(zhì)的表觀消化率(P＜0.05)。李光梅等[17]研究指出，在青海細(xì)毛羊飼糧中微生態(tài)制劑凍干粉（主要含乳酸菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌），可以顯著提高細(xì)毛羊DM、CP、EE和CF消化率(P＜0.05)，王有豐等[18]研究也證實(shí)了這一結(jié)果。王建國等[19]和楊朋飛[20]研究表明，飼糧中添加微生態(tài)制劑可以顯著提高奶牛DM、CP消化率，并可以改善NDF的消化能力。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，飼糧添加微生態(tài)制劑后，TG的養(yǎng)分表觀消化率與CG相比均有不同程度的提高，其DM表觀消化率顯著提高(P＜0.05)，CP、EE、NDF和ADF表觀消化率分別提高了1.18%、0.83%、2.32%和2.48%。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)采用真空冷凍法制備微生態(tài)制劑的活菌量≥1.35×1010CFU/g。

②飼糧中添加含量為5×1010CFU/(頭·d)的微生態(tài)制劑，可以顯著提高肉牛DM表觀消化率，改善CP、EE、NDF和ADF的消化能力。