響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的研究

■汪倫記 趙亞美 樊家康

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023）

畜牧業(yè)是我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中的支柱性產(chǎn)業(yè)。在動(dòng)物生產(chǎn)中，抗生素作為飼料添加劑得到廣泛應(yīng)用，給畜牧業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也造成抗生素殘留、耐藥菌株的產(chǎn)生和流行等食品安全問題[1-2]。歐盟和美國(guó)先后已禁止抗生素作為飼料添加劑使用。近年來(lái)，植物提取物以其安全、高效、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢(shì)，成為一種新型抗生素替代品[3]。中草藥作為抗生素替代品已開始在養(yǎng)殖業(yè)中得到應(yīng)用[4]。本研究選擇的冬凌草為我國(guó)特色中草藥，其含有二萜、三萜等多種萜類化合物以及甾體、黃酮、揮發(fā)油、生物堿和多糖等多種活性物質(zhì)。現(xiàn)代藥理學(xué)和毒理學(xué)研究表明，冬凌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗突變、調(diào)節(jié)免疫等生物活性。由于其具有顯著的抗菌消炎作用，冬凌草也被稱為“綠色抗生素”。作者的前期研究結(jié)果也表明，冬凌草對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、嗜水單胞菌、哈氏弧菌和鼠傷寒沙門氏菌等人畜共患病原菌具有一定的抑制作用[5]。

中草藥經(jīng)微生物發(fā)酵后，可以增加有效成分的利用率，提高藥效。微生物細(xì)胞含有的豐富酶系可以對(duì)中草藥的活性成分進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)生新的藥效物質(zhì)，同時(shí)可減少中草藥的毒副作用，節(jié)約資源[6]。因此，本文對(duì)飼用微生物黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的條件和營(yíng)養(yǎng)成分的變化進(jìn)行了研究，為冬凌草在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冬凌草購(gòu)于洛陽(yáng)，干燥后經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩；麩皮，購(gòu)于洛陽(yáng)；NaNO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、K2HPO4、NaOH、H2SO4、冰乙酸、乙酸鈉、丙酮、石油醚、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、瓊脂粉、葡萄糖均為分析純，購(gòu)于天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、羧甲基纖維素鈉均為分析純，購(gòu)于上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心保藏。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心，黑曲霉（Aspergillus nigerACCC 32589），購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-8222電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-20雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HJ-2A數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；FA2004N電子天平，上海菁海儀器有限公司；H1850R離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；PHS-3CpH計(jì)，上海智光儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液的制備

NaNO33 g/l、MgSO4·7H2O 0.5 g/l、KCl 0.5 g/l、Fe-SO4·7H2O 0.01 g/l、K2HPO41 g/l，用3 mol/l鹽酸調(diào)成所需pH值。

1.2.2 培養(yǎng)基

① 細(xì)菌斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母膏5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值7.2～7.4。121℃滅菌20 min備用。

② 細(xì)菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母膏5 g、蒸餾水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值7.2～7.4。121℃滅菌20 min備用。

③ 細(xì)菌平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母膏5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，用1 mol/l的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值7.2～7.4。121℃滅菌20 min備用。

④PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、自來(lái)水1 000 ml，自然pH值。121 ℃滅菌20 min備用。

1.2.3 細(xì)菌懸液制備

挑取1～2環(huán)接入細(xì)菌斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液。采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ脽o(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)菌含量為1×108cfu/ml。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

①冬凌草醇提物溶液制備：分別取發(fā)酵前和發(fā)酵后的冬凌草500 g，干燥后經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎，用95%乙醇在室溫下浸泡提取3次，合并提取液后減壓濃縮得到無(wú)醇味浸膏。取制備適量的冬凌草醇提物，用甲醇溶解后，配成不同質(zhì)量濃度的溶液，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②抑菌試驗(yàn)：滅菌吸管吸取制備的菌懸液1 ml加入100 ml已融化并保溫在水浴中（48～50℃）的細(xì)菌平板培養(yǎng)基內(nèi)，使菌含量達(dá)到1×106cfu/ml。融化后固體平板培養(yǎng)基冷卻45℃左右，加入1 ml制備好的菌液，然后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，等其凝固后，用無(wú)菌鑷子將滅菌牛津杯垂直放在含菌平板培養(yǎng)基表面，輕輕按壓（每個(gè)平板放4個(gè)牛津杯）。用移液器吸取100 μl冬凌草醇提物溶液，加入到牛津杯孔內(nèi)，同時(shí)用甲醇做空白對(duì)照。然后，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，細(xì)菌37℃培養(yǎng)15h后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 黑曲霉孢子懸液的制備

從冰箱取出一支保存的黑曲霉試管斜面，在超凈工作臺(tái)中加入無(wú)菌水，使無(wú)菌水剛好沒過(guò)斜面上的全部黑曲霉，然后用接種環(huán)把黑曲霉從斜面上輕輕刮下來(lái)，制成黑曲霉孢子懸液。

1.2.6 固態(tài)發(fā)酵工藝流程

稱取冬凌草和麩皮于250 ml三角燒瓶中，裝瓶量為20 g，加入基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液，用玻璃棒攪拌均勻，然后用透氣封口膜封口，于滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20 min。滅菌完成后，在超凈工作臺(tái)中，用移液槍吸取所需體積的黑曲霉孢子懸液于三角燒瓶中，用滅過(guò)菌的玻璃棒攪拌均勻，用封口膜封口后，放入霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，間隔一定時(shí)間搖動(dòng)拍打三角燒瓶，使均勻發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活力，探究最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.7 固態(tài)發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

①接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

冬凌草與麩皮比1∶4(g∶g)，固液比為2∶1(g∶ml)，培養(yǎng)溫度28℃，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值8，接種量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，每組3個(gè)重復(fù)。

②溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

冬凌草與麩皮比1∶4(g∶g)，固液比為2∶1(g∶ml)，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值8，接種量1.5%，培養(yǎng)溫度分別為25、28、31、34、37℃，每組3個(gè)重復(fù)。

③pH值對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

冬凌草與麩皮比1∶4(g∶g)，固液比為2∶1(g∶ml)，培養(yǎng)溫度31℃，接種量1.5%，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值分別為4、5、6、7、8，每組3個(gè)重復(fù)。

④冬凌草與麩皮比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

固液比為2∶1（g∶ml），培養(yǎng)溫度31 ℃，接種量1.5%，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值7，冬凌草與麩皮比（g∶g）分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，每組3個(gè)重復(fù)。

⑤固液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)溫度31℃，接種量1.5%，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值7，冬凌草與麩皮比1∶4，固液比（g∶ml）分別為2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.8 響應(yīng)曲面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取冬凌草與麩皮比A、固液比B和接種量C為影響因素，以纖維素酶活力Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵條件參數(shù)，如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.2.9 纖維素酶活力的測(cè)定

按照NY/T 912—2004《飼料添加劑纖維素酶活力的測(cè)定分光光度計(jì)法》測(cè)定纖維素酶活力[8]。

纖維素酶活力單位：在37℃，pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

纖維素酶液的制備：固體樣品應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過(guò)60目篩，稱取試樣2份，精確至0.001 g。加入40 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。磁力攪拌30 min，再用緩沖溶液定容至100 ml，在4℃條件下避光保存24 h。搖勻，取出30～50 ml，離心機(jī)離心3 min。吸取5 ml上清液，再用緩沖溶液做二次稀釋（稀釋后的待測(cè)酶液中纖維素酶活力最好能控制在0.04～0.08U/ml）。

試樣酶活力的計(jì)算：

式中：XD——試樣稀釋液的纖維素酶活力(U/ml)；

AE——酶反應(yīng)液的吸光度；

AB——酶空白樣的吸光度；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

M——葡萄糖的摩爾質(zhì)量M(C6H12O6)=180.2g/mol;

t——酶解反應(yīng)時(shí)間(min)；

1 000 ——轉(zhuǎn)換因子，1mmol=1 000μmol；

C0——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距。

式中：X——試樣纖維素酶的活力(U/g)；

Df——試樣的總稀釋倍數(shù)。

繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.907 9x+0.104 3，R2=0.999 4。

1.2.10 飼料各種指標(biāo)測(cè)定

粗纖維按照GB/T 6434—2006/ISO 6865:2000《飼料中粗纖維的含量測(cè)定過(guò)濾法》；粗灰分按照GB/T 6438—2007/ISO 5984:2002《飼料中粗灰分的測(cè)定》；粗脂肪按照GB/T 6433—2006/ISO 6492:1999《飼料中粗脂肪的測(cè)定》；粗蛋白質(zhì)按照GB/T 6432—94《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》；還原糖采用DNS法（3,5-二硝基水楊酸比色法）[9]，繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.267x+0.035 8，R2=0.999 1。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的單因素實(shí)驗(yàn)

冬凌草與麩皮的比、接種量、溫度、pH值和固液比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響見圖1。由圖1(a)可知，隨著接種量的增加，纖維素酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為1.5%時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大值。由圖1(b)可知，隨著溫度的增加，纖維素酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為31℃時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大值。圖1(c)顯示，當(dāng)基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液的pH值為7時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大值。圖1(d)顯示冬凌草與麩皮比為1∶4時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大值。圖1(e)顯示纖維素酶活力隨著固液比的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)固液比為1∶1.5時(shí)達(dá)到最大值。

圖1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定固態(tài)發(fā)酵溫度為31℃，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值7。以冬凌草與麩皮比（A）、固液比（B）和接種量(C)為自變量，以纖維素酶活力（Y）為響應(yīng)值，以Design-Expert8.0軟件，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

采用Design-Expert8.0軟件對(duì)以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程[10]，多元回歸分析得到纖維素酶活力與各因素變量的二次方程模型為：

并對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，各項(xiàng)回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型顯著（P＜0.000 1），并且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.100 2＞0.05），R2=0.975 7、R2Adj=0.944 5，說(shuō)明此模型能解釋94.45%響應(yīng)區(qū)面的變化，多項(xiàng)回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合良好，因此該模型可以真實(shí)地?cái)M合和預(yù)測(cè)實(shí)際情況。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)纖維素酶活力影響極顯著，二次項(xiàng)C2對(duì)纖維素酶活力影響顯著，其余項(xiàng)的影響均不顯著。由此可見，冬凌草與麩皮比、固液比對(duì)纖維素酶活力影響極顯著，接種量對(duì)纖維素酶活力影響不顯著。3個(gè)因素影響酶活力大小的主次依次為：B＞A＞C，即固液比＞冬凌草與麩皮比＞接種量。

為了考察各因素交互作用對(duì)纖維素酶活力的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維分析[11]，研究接種量、固液比、冬凌草與麩皮比兩兩因素之間的交互作用，其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面及等高線圖如圖2所示。

由圖2(a)的響應(yīng)面圖可以看出：固液比對(duì)纖維素酶活力的影響較顯著，曲面較陡，隨著固液比的增大，纖維素酶活力呈現(xiàn)先快速增加后緩慢降低的趨勢(shì)；冬凌草與麩皮比對(duì)纖維素酶活力的影響不太顯著，曲面較緩和，隨著冬凌草與麩皮比的增大，纖維素酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖2(a)的等高線圖可以看出，沿固液比軸向等高線密集，而冬凌草與麩皮比軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明固液比對(duì)纖維素酶活力的影響比冬凌草與麩皮比大，等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較顯著。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

由圖2(b)的響應(yīng)面圖可以看出，冬凌草與麩皮比對(duì)纖維素酶活力的影響較顯著，曲面較陡，隨著冬凌草與麩皮比的增大，纖維素酶活力呈現(xiàn)先快速增加后快速下降的趨勢(shì)；接種量對(duì)纖維素酶活力的影響不太顯著，曲面較緩和，隨著接種量的增加，纖維素酶活力呈現(xiàn)先緩慢增加后緩慢減小的趨勢(shì)。由圖2(b)的等高線圖可以看出，沿冬凌草與麩皮比軸向等高線密集，而接種量軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明冬凌草與麩皮比對(duì)纖維素酶活力的影響比接種量大，等高線呈近似橢圓形，說(shuō)明兩因素具有一定的交互作用。

由圖2(c)的響應(yīng)面圖可以看出，固液比對(duì)纖維素酶活力的影響較顯著，曲面較陡，隨著固液比的增大，纖維素酶活力呈現(xiàn)先快速增加后緩慢降低的趨勢(shì)；接種量對(duì)纖維素酶活力的影響不太顯著，曲面較緩和，隨著接種量的增大，纖維素酶活力呈現(xiàn)先緩慢增大后緩慢減小的趨勢(shì)。由圖2(c)的等高線圖可以看出，沿固液比軸向等高線密集，而接種量軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明固液比對(duì)纖維素酶活力的影響比接種量大，等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較顯著。

圖2 各因素間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

根據(jù)回歸模型，通過(guò)Design Expert 8.0軟件分析得出黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的最優(yōu)條件為：冬凌草與麩皮比為1∶3.86（g∶g），固液比為1∶1.73（g∶ml），接種量為1.59%，預(yù)測(cè)得到的纖維素酶活力為16.67 U/g。對(duì)該最優(yōu)條件進(jìn)行模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將最優(yōu)條件參數(shù)修正為：冬凌草與麩皮比為1∶3.9（g∶g），固液比為 1∶1.7（g∶ml），接種量為1.6%，通過(guò)三組重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到纖維素酶活力的平均值為16.49 U/g，比理論值下降1.08%，小于5%，實(shí)驗(yàn)值與理論值基本吻合，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況擬合良好。

2.3 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草前后成分變化(見表4)

表4 發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比(%)

由表4可知，冬凌草經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后，粗纖維由發(fā)酵前的34.35%降低到31.07%，降低了9.55%；粗灰分由發(fā)酵前的7.81%降低到5.69%，降低了27.14%；還原糖由發(fā)酵前的3.92%降低到1.13%，降低了71.17%；粗脂肪由發(fā)酵前的2.87%增加到3.35%，增加了16.72%；粗蛋白質(zhì)由發(fā)酵前的10.62%增加到12.95%，增加了21.94%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有了明顯的提高。

以S.aureus、E.coli、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida為供試菌。對(duì)冬凌草發(fā)酵前后的抑菌活性進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，冬凌草發(fā)酵后的醇提物對(duì)S.aureus、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida、E.coli的抑制作用表現(xiàn)出增強(qiáng)作用。

表5 冬凌草醇提物的抑菌作用（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=9）

3 討論

3.1 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的條件優(yōu)化

冬凌草為一種多年生的草本植物，含有難分解利用的纖維素與半纖維素。因此，篩選適宜發(fā)酵的菌種，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可以最大限度地利用以中藥材為主要組分的培養(yǎng)基，釋放和產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)。黑曲霉是一種飼用真核微生物，能產(chǎn)生分解纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)的酶類，對(duì)纖維素具有較強(qiáng)的分解利用能力，是發(fā)酵中藥的主要功能菌。本實(shí)驗(yàn)中以冬凌草為原料，同時(shí)添加適量的麩皮作為輔料，接種黑曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，由于麩皮含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，黑曲霉生長(zhǎng)良好，纖維素酶的活性也較高。

3.2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草前后成分變化

中草藥經(jīng)飼用微生物發(fā)酵后，由于微生物生長(zhǎng)過(guò)程中分泌分解纖維素和木質(zhì)素的酶，因此，能將中草藥中的纖維素、木質(zhì)素類等大分子物質(zhì)降解，同時(shí)也可將中草藥轉(zhuǎn)化為菌體蛋白和多糖等，并使中藥充分釋放有效成分，提高其有效成分的含量。本實(shí)驗(yàn)中，以冬凌草為主料，麩皮為輔料，經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵物中粗纖維、粗灰分和還原糖含量降低，而粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量得到增加。對(duì)冬凌草發(fā)酵后的醇提物抑菌試驗(yàn)顯示，其抑菌活性表現(xiàn)出增強(qiáng)作用，表明冬凌草經(jīng)過(guò)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后，其抑菌活性成分更容易釋放出來(lái)。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的條件進(jìn)行了優(yōu)化。獲得最佳條件為：冬凌草與麩皮比為1∶3.9（g∶g），固液比為1∶1.7（g∶ml），接種量為1.6%，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)鹽液pH值7，發(fā)酵溫度為31℃。在此培養(yǎng)條件下，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的活力最高，發(fā)酵72 h，纖維素酶活力達(dá)到了16.49 U/g。對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵冬凌草的成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，粗纖維含量降低了9.55%；粗灰分下降了27.14%，還原糖減少了71.17%；粗脂肪含量增加了16.72%；粗蛋白質(zhì)含量增加了21.94%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有了一定提高。冬凌草發(fā)酵后的醇提物對(duì)S.aureus、B.subtilis、S.epidermidis、P.multocida、E.coli的抑制作用表現(xiàn)出增強(qiáng)作用。