預消化蛋白對小鼠免疫性能的影響

■楊 洋 權(quán)志中 呂秋鳳* 楊 寧 李曉玲 王 楠 董公麟 呂允濤

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽110161；2.沈陽市康普利德生物科技有限公司，遼寧沈陽110161；3.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧鐵嶺112611)

蛋白質(zhì)是動物飼料中非常重要的營養(yǎng)源，但受不同蛋白飼料來源和動物的不同生理階段(如斷奶、疾病、應激條件下)影響，機體對蛋白質(zhì)的消化、吸收往往存在一定的障礙，因此，對蛋白原料進行體外預消化處理十分必要。飼料預消化處理即采用體外模擬動物消化過程，根據(jù)不同原料所具有的不同特征進行一定的加工處理，使其轉(zhuǎn)變成易于動物機體吸收的營養(yǎng)成分，同時消除原料中有毒有害物質(zhì)，提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用的一種新型飼料加工技術(shù)[1]。

目前對蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)的消化吸收機制的理論解釋中，公認的主流學說是蛋白質(zhì)在腸道的吸收主要以氨基酸和小肽為主，大分子蛋白必須通過動物機體的酶解作用才能夠被小腸吸收利用，這是一個生物耗能過程。研究表明，斷奶、疾病等應激條件下，動物腸黏膜形態(tài)發(fā)生改變、絨毛受損、黏膜細胞能量供應不足，就會引起上皮細胞損傷及其功能紊亂，進而降低機體對營養(yǎng)素的吸能力。飼糧谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸是小腸黏膜的主要燃料，為營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等腸道ATP依賴性的代謝過程提供能量。通過向豬十二指腸灌注小肽后，血漿胰島素的濃度高于灌注游離氨基酸，而胰島素的生理功能之一即參與蛋白質(zhì)合成中肽鏈的延伸，增加蛋白質(zhì)的合成。王恬等[2]研究發(fā)現(xiàn)小肽能刺激小腸絨毛增生，促進幼齡動物小腸發(fā)育成熟。這些研究提示我們在動物腸道營養(yǎng)中氨基酸和小肽均有作用，且有可能存在互作。蛋白質(zhì)預消化處理后的產(chǎn)物主要由氨基酸和小肽以及一些生物大分子組成，較早期的研究表明可以改善動物的生長性能，但這些混合成分對腸道健康的影響機制并不清楚。腸道作為消化器官直接與外界相通，而腸道黏膜系統(tǒng)作為機體最大的非特異性免疫器官，其功能狀態(tài)直接影響機體的免疫水平。因此，研究蛋白質(zhì)預消化處理產(chǎn)物對腸道組織形態(tài)學以及機體免疫能力的影響十分必要。本研究旨在通過觀察預消化蛋白對小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腹腔巨噬細胞吞噬能力、免疫器官指數(shù)、腸黏膜SIgA等免疫指標的影響，為預消化蛋白在動物生產(chǎn)中的合理應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

預消化蛋白購于沈陽市康普利德生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物

SPF(Specific pathogen free，無特定病原體級)小鼠，體重18～22 g，雄性，購于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗分組：取小鼠240只，隨機分成3組，每組4個重復，每個重復20只。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗一組的日糧中預消化蛋白添加量為2.5%，試驗二組的日糧中預消化蛋白添加量為5%，試驗設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計

1.2.3 飼養(yǎng)管理

小鼠自由采食，每天換水1次，每周更換墊料2次，消毒2次，環(huán)境溫度20～30℃。

1.3 測定指標

1.3.1 十二指腸形態(tài)學指標測定

試驗進行6周后，每個處理的每個重復隨機選取3只小鼠，剪取十二指腸中段腸管3 cm，用蒸餾水輕輕洗凈內(nèi)容物后，立即置于固定液中固定。采用HE染色法染色，以IAS.BV4.4圖像軟件分析，測定絨毛長度和隱窩深度，計算絨毛長度/隱窩深度比值。

1.3.2 小鼠免疫器官指數(shù)測定

試驗過程中，每周從每個重復組中隨機取出1只健康小鼠，稱重后采用頸椎脫臼的方法將小鼠處死，分離脾臟和胸腺，用濾紙吸干水分后分別稱重，計算免疫器官指數(shù)。

1.3.3 小鼠巨噬細胞吞噬能力指標測定

采用臺盼藍染色法，試驗飼養(yǎng)周期結(jié)束的前2 d，從每個處理組每個重復中隨機取3只小鼠，分別用注射器抽取1 ml臺盼藍染色液注入小鼠腹腔內(nèi)并將小鼠進行標記。試驗結(jié)束后，抽取上述標記小鼠的腹腔液于鏡下觀察并記錄不同視野下100個吞噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)和被巨噬細胞吞噬的雞紅細胞數(shù)。

1.3.4 小腸黏膜SIgA表達水平的測定

試驗過程中，每周從每個重復組中隨機選出1只小鼠，宰殺解剖后分別切取十二指腸段、空腸段、回腸段各3 cm左右。按照ELISA試劑盒使用說明書通過酶標儀進行測定腸道黏膜SIgA的表達水平。試劑盒購置于德國IBI分裝公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用IDE和Duncan's法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 預消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)學的影響(見表2、圖1)

表2 預消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)學的影響

圖1 預消化蛋白對小鼠十二指腸形態(tài)的影響

由表2可知，試驗組小鼠十二指腸絨毛長度與對照組相比分別提高11.31%和8.84%(P＜0.05)，試驗組小鼠十二指腸絨毛長度/隱窩深度與對照組相比分別提高18.32%和14.66%(P＜0.05)，試驗組隱窩深度與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，但有降低趨勢。試驗組之間的小鼠十二指腸絨毛長度、隱窩深度及V/C均差異不顯著(P＞0.05)。綜上所述，預消化蛋白可以顯著提高小鼠十二指腸絨毛長度和絨毛長度/隱窩深度比值(P＜0.05)，有降低隱窩深度的趨勢(P＞0.05)。

圖1顯示，對照組小鼠十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列疏松，但絨毛長度不均等；試驗一組的絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列緊密、長度增長且均等、隱窩深度降低；試驗二組絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列緊密，但絨毛長度不均等。

2.2 預消化蛋白對小鼠巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響(見表3)

表3 預消化蛋白對小鼠巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響

由表3可知，試驗組小鼠巨噬細胞吞噬率與對照組相比均顯著提高(P＜0.05)，其中試驗一組的吞噬率與對照組相比提高了14.56%，試驗二組吞噬率與對照組相比提高了6.27%，且兩個試驗組之間差異顯著(P＜0.05)。但試驗組的吞噬指數(shù)與對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)。

2.3 預消化蛋白對小鼠免疫器官指數(shù)的影響(見表4)

表4 預消化蛋白對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表4可知，在整個試驗過程中，對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)逐漸降低，各試驗組的脾臟指數(shù)先升高后降低，而胸腺指數(shù)逐漸降低，但降低速度緩慢。試驗一組脾臟指數(shù)與對照組相比的優(yōu)勢逐漸增強，并在試驗進行6周后優(yōu)勢達到最優(yōu)，比對照組提高21.00%(P＜0.05)；試驗二組在試驗進行3周后脾臟指數(shù)與對照組相比優(yōu)勢最強，與對照組相比提高14.50%(P＜0.05)，之后降低，但整體均優(yōu)于對照組；試驗組胸腺指數(shù)與對照組相比均有提高，其中試驗進行6周后試驗組胸腺指數(shù)與對照組相比分別提高17.69%和13.08%(P＜0.05)。試驗結(jié)果證明，預消化蛋白能夠提高小鼠免疫器官指數(shù)，提高機體非特異性免疫水平。

2.4 預消化蛋白對小鼠腸黏膜SIgA的影響(見表5)

表5 預消化蛋白對小鼠腸黏膜SIgA的影響(ng/ml)

由表5可知，試驗過程中，小鼠十二指腸黏膜SI-gA表達水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，前3周逐漸上升，第4周忽然降低后又逐漸上升?？傮w來看，試驗組與對照組相比，除1周后試驗二組十二指腸黏膜SIgA表達水平略低于對照組，其余時間段試驗組均高于對照組。其中試驗進行2周后，試驗二組十二指腸腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比有所提高（P＞0.05），并與試驗進行的4周后達到顯著水平(P＜0.05)，至6周后雖仍高于對照，但差異已趨平緩(P＞0.05)。試驗進行2周后，試驗一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達水平提高7.89%(P＜0.05)。試驗進行3周后，試驗一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達水平提高了13.18%(P＜0.05)。試驗進行4周后，試驗組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達水平分別提高了13.78%和6.73%(P＜0.05)。試驗進行5周后，試驗組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達水平分別提高26.19%和9.58%(P＜0.05)。試驗進行6周后，試驗一組與對照組相比，十二指腸黏膜SIgA表達水提高14.56%(P＜0.05)，在試驗進行2周到6周期間，兩個試驗組之間差異均顯著(P＜0.05)。

小鼠空腸黏膜SIgA表達水平的動態(tài)變化趨勢與十二指腸表現(xiàn)基本一致。試驗進行1周后，試驗一組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比提高了23.85%(P＜0.05)，試驗二組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。試驗進行2周后，兩個試驗組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比分別提高了22.31%和9.14%(P＜0.05)；試驗進行3周后，試驗一組空腸黏膜SIgA表達水平顯著高于對照組，提高5.44%(P＜0.05)，而試驗組二空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，兩試驗組之間差異不顯著(P＞0.05)；試驗進行4周后，試驗組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比分別提高了19.99%和6.37%(P＜0.05)，且試驗組之間差異顯著(P＜0.05)；試驗進行5周后，試驗組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比分別提高了18.40%和8.93%(P＜0.05)，且試驗組之間差異顯著(P＜0.05)。試驗進行6周后，試驗組空腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比分別提高了10.00%和9.29%(P＜0.05)，且試驗組之間差異不顯著(P＞0.05)。

小鼠回腸黏膜SIgA的變化趨勢也與十二指腸表現(xiàn)基本一致。試驗進行1周后，試驗組回腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)；試驗進行2周到6周中，試驗組回腸黏膜SIgA表達水平與對照組相比均顯著提高，由2周到6周試驗組依次分別提高了11.69%和6.64%(P＜0.05)、24.58%和13.49%(P＜0.05)、18.26%和 17.74%(P＜0.05)、8.41%和 6.87%(P＜0.05)、10.72%和9.86%(P＜0.05)，其中飼喂3周時回腸SIgA表達水平提高最多。

3 討論

3.1 預消化蛋白對腸道形態(tài)學的影響

王恬等[2]在小肽營養(yǎng)素對斷奶仔豬小腸發(fā)育的影響中研究表明，小肽能刺激小腸絨毛增生,促進幼齡動物小腸的發(fā)育成熟。斷奶仔豬日糧中添加小肽營養(yǎng)素可以減輕由于仔豬斷奶后引起的小腸絨毛萎縮,刺激仔豬腸道組織與功能的發(fā)育，改善十二指腸的形態(tài)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。祝平等[3]在植物小肽對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響中研究表明，植物小肽能夠促進仔豬在斷奶后腸道形態(tài)完整性，提高仔豬腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，這種趨勢隨著植物小肽添加量的增加而提高。這些試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果具有一致性。本試驗結(jié)果證明，預消化蛋白可以提高腸絨毛長度和V/C比值，降低隱窩深度，促進腸道形態(tài)的完整，進而增強小鼠的免疫能力。

3.2 預消化蛋白對巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響

吞噬細胞的吞噬作用是非特異性免疫的重要組成部分。因此測定機體吞噬細胞的能力對了解機體的免疫功能具有十分重要的意義。

本試驗中，預消化蛋白組的巨噬細胞吞噬率均高于對照組，三組之間具有顯著差異，且以2.5%組表觀更優(yōu)，李紅勝[4]在大豆肽的制備及其小鼠免疫功能的影響中試驗結(jié)果表明，添加大豆肽可以提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力，與本試驗結(jié)果表現(xiàn)一致。說明預消化蛋白可以提高巨噬細胞的吞噬能力，提高小鼠自身的非特異性免疫能力。由于非特異性免疫力是特異性免疫的基礎(chǔ)，巨噬細胞吞噬能力的增強可以促進血液中免疫球蛋白的表達，繼而提高機體的免疫能力。

3.3 預消化蛋白對免疫器官指數(shù)的影響

試驗過程中，小鼠的脾臟指數(shù)呈現(xiàn)動態(tài)變化，整體表現(xiàn)平穩(wěn)，沒有大起大落，說明在小鼠的正常生長周期中，不會出現(xiàn)免疫亢進或免疫抑制的情況，免疫功能逐漸完善并趨于穩(wěn)定。添加預消化蛋白的兩組脾臟指數(shù)從第2周開始顯著高于對照組，且以試驗一組表現(xiàn)更優(yōu)。脾臟是機體中最大的免疫器官，是免疫應答的重要場所。脾臟內(nèi)富含有B淋巴細胞和漿細胞，產(chǎn)生抗體。B細胞對血清中抗體水平尤其是IgM和IgG的表達水平具有很大作用。

從胸腺指數(shù)來看，隨著試驗的推進呈逐漸降低趨勢，這主要與胸腺本身會隨年齡增長逐漸退化，最后被脂肪代替相關(guān)。但在整個試驗過程中，兩個試驗組的胸腺指數(shù)降低速度相比對照組緩慢，且隨著年齡增長差異顯著，說明預消化蛋白可以延緩胸腺的退化。機體的免疫能力與胸腺的生長周期密切相關(guān)，預消化蛋白延緩胸腺的退化，將對小鼠胸腺中T淋巴細胞分化成熟產(chǎn)生抗體起促進作用。

由此可見，預消化蛋白對促進免疫器官健康發(fā)育，提高機體體液免疫能力具有積極的作用。

3.4 預消化蛋白對腸黏膜免疫的影響

本試驗過程中，小鼠各腸段腸黏膜SIgA呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，前3周逐漸上升，但在第4周的時候出現(xiàn)了全群下降，之后又恢復上升趨勢，說明小鼠的免疫能力隨著年齡的增長逐漸發(fā)展和完善，第4周的全群變化可能與氣候突變導致應激所致。

試驗結(jié)果表明，從第2周開始預消化蛋白顯著提高了小鼠十二指腸、空腸和回腸黏膜SIgA表達水平，且試驗一組效果優(yōu)于試驗二組。楊小軍[5]在“灌胃大豆蛋白、面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物對大鼠免疫功能的影響”中研究表明，灌喂兩種蛋白水解液能顯著提高腸腔SIgA水平，與本試驗結(jié)果表現(xiàn)一致。SIgA是腸道黏膜免疫的核心，本試驗結(jié)果說明預消化蛋白對小鼠的腸黏膜免疫功能具有促進作用。

4 結(jié)論

綜上所述，預消化蛋白對小鼠腸道的健康發(fā)育和免疫能力具有顯著的促進和提高作用，且綜合各檢測指標的檢驗結(jié)果以2.5%的添加量為宜。