高通量測(cè)序研究膨化秸稈生物發(fā)酵飼料對(duì)遼育白牛腸道菌群的影響

■楊淑華陳 帥,2李 鵬 龍 淼 李 林佟 翠張?jiān)娒群蝿Ρ?

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省愛普羅斯飼料有限公司,遼寧 沈陽(yáng) 110164)

反芻動(dòng)物具有復(fù)雜的胃腸道環(huán)境，而且處于平穩(wěn)狀態(tài)，一旦出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)水平的改變、疾病、應(yīng)激等因素，微生物菌群會(huì)出現(xiàn)變化，并直接影響著動(dòng)物的機(jī)體狀況。而膨化秸稈生物發(fā)酵飼料通過外源加入的腸道有益菌，更能有效調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，為機(jī)體健康提供一個(gè)有效的保證。腸道是動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場(chǎng)所，胃內(nèi)沒有充分消化的食物，會(huì)進(jìn)入腸道完成二次消化，為機(jī)體充分地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供保障。腸道內(nèi)豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)通過協(xié)同作用，可以有效分解利用不易消化的粗纖維飼料。

Orin C.Shanks等（2011）從6個(gè)不同的牛群，每個(gè)牛群選取5頭健康的牛，被平均分配到3個(gè)處理組，1組：飼糧中粗飼料的比例達(dá)80%；2組：飼糧中粗飼料比例達(dá)75%；3組：飼糧中的顆粒玉米比例達(dá)75%，飼喂90 d后，采集直腸糞便進(jìn)行菌群分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落主要屬于硬壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，而在不同門分類水平上，由于飼糧精粗比不同，不同菌屬也存在較大的差異。G.J.Lascano等（2013）將體重相近的8頭荷斯坦奶牛，隨機(jī)分成兩個(gè)處理組，飼糧中粗纖維高低水平不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：粗纖維較高的處理組，糞便中的纖維分解菌屬、丁酸弧菌屬的數(shù)量明顯增加，而細(xì)菌總量也照常規(guī)飼喂高出近50%。以往研究發(fā)現(xiàn)，飼喂膨化秸稈生物發(fā)酵飼料可促進(jìn)肉牛的生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化效率，可替代部分精料（崔樹和，2015），然而其具體機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)通過在遼育白牛飼料中添加不同比例的膨化秸稈發(fā)酵飼料，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)遼育白牛直腸糞便的菌群進(jìn)行分析，以探究膨化秸稈生物發(fā)酵飼料對(duì)遼育白牛腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)管理

選擇健康無疾病的遼育白牛40頭體重相近[（300～350）kg]組建試驗(yàn)牛群。將試驗(yàn)牛按照隨機(jī)分組的原則，分為4組，每組10個(gè)重復(fù)，經(jīng)方差檢驗(yàn)，各組間初始體重差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)前所有試驗(yàn)牛用伊維菌素進(jìn)行驅(qū)蟲，大黃蘇打粉健胃。

試驗(yàn)時(shí)間為2016年5月～2016年11月，試驗(yàn)全期為160 d，其中預(yù)試期30 d，正試期130 d。試驗(yàn)地點(diǎn)為遼寧省阜新市彰武長(zhǎng)青牧業(yè)，試驗(yàn)牛采用散養(yǎng)育肥模式，定期消毒，每天5：00和17：00飼喂，牛群采用自由飲水。每天按時(shí)觀察牛群的健康狀況，對(duì)特殊情況及時(shí)處理，免疫按照牛場(chǎng)以前程序執(zhí)行。

1.2 試驗(yàn)處理與組別

試驗(yàn)分為4組，對(duì)照組（100%基礎(chǔ)精料+黃貯飼料）、試驗(yàn)1組（80%基礎(chǔ)精料+膨化秸稈生物發(fā)酵飼料）、試驗(yàn)2組（70%基礎(chǔ)精料+膨化秸稈生物發(fā)酵飼料）、試驗(yàn)3組（60%基礎(chǔ)精料+膨化秸稈生物發(fā)酵飼料）。其中100%精料即按體重的1.2%給予精料。

1.3 試驗(yàn)日糧組成

膨化秸稈生物發(fā)酵飼料由遼寧省阜新市祥和牧業(yè)提供。4個(gè)組采用相同的精料日糧配方，在試驗(yàn)過程中為避免瘤胃酸中毒，適當(dāng)隨黃貯飼料、膨化秸稈飼料添加量的增多，逐漸增加小蘇打的量，日糧組成水平見表1。

表1 日糧組成（%）

1.4 試驗(yàn)主要試劑及試驗(yàn)儀器

主要試劑：E.Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA公司)，Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒(Life公司)，Taq DNA Polymerase(Thermo公司)，Agencourt AMPure XP（Beckman公司）。

主要儀器：Qubit?2.0熒光計(jì)(Invitrogen Q32866)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP)，PCR 儀(Eppendorf，T100TMThermal Cyeler)，電泳儀電源（北京市六一儀器廠，DYY-6C型），臺(tái)式離心機(jī)（Thermo Fisher，Pico-21）。

1.5 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3頭遼育白牛，無菌直腸取糞，放入5 ml凍存管內(nèi)，在液氮罐內(nèi)凍存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃超低溫冰箱中，用于糞便菌群的分析。

1.6 提取DNA及測(cè)序

提取DNA的步驟參照基因組DNA抽提試劑盒(OMEGA公司)的使用說明書完成。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V4-V5通用引物，對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。針對(duì)16S rRNA基因V4～V5區(qū)，合成帶有barcode的特異引物。利用 515F（5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3’）909R（5’-AGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’）兩種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過barcode區(qū)分樣品序列，將各樣本序列進(jìn)行質(zhì)量控制過濾后，對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析及菌群構(gòu)成分析。Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括豐富度指數(shù)（Chao1/Ace指數(shù)）、多樣性指數(shù)（Simpson/Shannon指數(shù)）等。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌群組成分析

為得到每個(gè)操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）對(duì)應(yīng)的物種分類信息,首先需要對(duì)OTU進(jìn)行物種分類，其次通過RDP和Blast兩種方法，參照物種分類數(shù)據(jù)庫(kù)，將細(xì)菌進(jìn)行門、科、屬水平的分類。

2.1.1 門水平菌群組成

糞便樣本經(jīng)高通量生物學(xué)信息分析，共得到15個(gè)菌門，相對(duì)豐度大于1%的門類見表2，其余相對(duì)豐度低于1%的門類見圖1。經(jīng)分析可以得出：擬桿菌門、厚壁菌門為糞便細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌門，添加膨化秸稈生物發(fā)酵飼料的3個(gè)試驗(yàn)組中厚壁菌門、螺旋體門的相對(duì)豐度都有所提高，擬桿菌門相對(duì)豐度有所下降。其中試驗(yàn)2組中厚壁菌門、螺旋體門的相對(duì)豐度顯著高于其他三個(gè)組，且差異顯著（P＜0.05），擬桿菌門相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組、試驗(yàn)3組且差異顯著（P＜0.05）。

表2 糞便門水平菌群組成（%）

圖1 糞便細(xì)菌門水平菌群組成

2.1.2 屬水平菌群組成

糞便樣本經(jīng)過分類共得到49個(gè)屬，剩下的記為other。表3是糞便細(xì)菌屬水平主要的物種組成，其余的豐度較低的見圖2。經(jīng)分析得出：孢桿菌屬為糞便細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬，對(duì)照組孢桿菌屬相對(duì)豐度高于3個(gè)試驗(yàn)組，但差異不顯著(P＞0.05),帕拉普氏菌屬相對(duì)豐度高于3個(gè)試驗(yàn)組，差異顯著(P＜0.05)。3個(gè)試驗(yàn)組的擬桿菌屬、顫桿菌克相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)2組梭菌屬IV相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)3組(P＜0.05)，試驗(yàn)1組擬普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度顯著高于其他3組(P＜0.05)。

表3 糞便細(xì)菌屬水平主要菌群組成(%)

圖2 糞便細(xì)菌屬水平菌群組成

2.2 Alpha多樣性分析

利用Mothur軟件對(duì)每個(gè)樣品的OTU數(shù)量（相似水平97%以上）進(jìn)行計(jì)算，OTU數(shù)量可以代表樣品物種的豐度（Zhang M L，2009）。由表4可知，在所有樣品中，試驗(yàn)4樣品OTU數(shù)量最多，對(duì)照組最少，這表明試驗(yàn)組牛糞便中菌群的豐度很高，并且各試驗(yàn)組與對(duì)照組間的菌群豐度存在較大差異。

對(duì)單樣本進(jìn)行微生物多樣性(Alpha)分析，可以反映微生物群落的豐度和多樣性，運(yùn)用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)來估計(jì)樣本中的物種豐度和多樣性。由表4可以看出：對(duì)照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組的糞便樣本中的微生物辛普森指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組，試驗(yàn)3組的糞便樣本中的香濃指數(shù)、艾斯指數(shù)、趙氏指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。對(duì)照組和試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組的糞便樣本中的香濃指數(shù)、艾斯指數(shù)、趙氏指數(shù)差異顯著(P＜0.05)，對(duì)照組和試驗(yàn)3組糞便樣本中的香濃指數(shù)、艾斯指數(shù)、趙氏指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。

表4 糞便多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

腸道中微生物的變化與糞便菌群的構(gòu)成正相關(guān)，因此對(duì)糞便菌群多樣性的研究可以幫助人們深入研究腸道菌群的變化（王麗鳳，2014）。近年來，在各研究領(lǐng)域中更多地采用分子生物技術(shù)來對(duì)微生物群落進(jìn)行分析，其中主要方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)、構(gòu)建克隆文庫(kù)等（李袁飛，2015；Fifuerola，2007）。比較而言，高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究具有準(zhǔn)確定量、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)(Li，2010；Tang，2012)。曾燕（2015）對(duì)成年健康綿羊腸道內(nèi)的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的細(xì)菌主要來源于11個(gè)門的菌群，其中厚壁菌門占(44.37%)、擬桿菌門占(38.73%)，表明厚壁菌門和擬桿菌門為成年健康綿羊腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。Shanks(2011)采集健康肉牛的糞便進(jìn)行宏基因組測(cè)序，雖然飼喂的條件不同，但主要微生物群落都屬于厚壁菌門和擬桿菌門。楊偉平（2015）采用DGGE方法研究藏豬腸道中細(xì)菌群落組成，擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究細(xì)菌腸道中細(xì)菌的多樣性發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門厚壁菌門為最豐富的細(xì)菌群類。本試驗(yàn)在遼育白牛日糧中添加不同比例的膨化秸稈生物發(fā)酵飼料，取直腸內(nèi)糞便，對(duì)腸道菌群進(jìn)行宏基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在門水平上，直腸中的優(yōu)勢(shì)菌群主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，這與以往國(guó)內(nèi)外研究基本一致。

試驗(yàn)動(dòng)物不同，在屬的水平上存在種屬差異。朱巖麗（2013）用一定纖維水平的粗日糧飼喂家兔，發(fā)現(xiàn)直腸中優(yōu)勢(shì)菌屬為孢桿菌屬、瘤胃球菌屬。王鵬（2015）在育肥豬日糧中添加膨化秸稈生物發(fā)酵飼料，發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬、琥珀酸弧菌屬等纖維素分解菌屬隨著膨化秸稈生物發(fā)酵飼料添加量的增加而增加，增加的纖維素分解菌屬與本試驗(yàn)結(jié)果有部分不同。本試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，孢桿菌屬、擬桿菌屬為遼育白牛糞便的優(yōu)勢(shì)菌屬，孢桿菌屬具有一定的纖維素分解能力，擬桿菌屬具有消化碳水化合物的作用。添加膨化秸稈生物發(fā)酵飼料量的3個(gè)試驗(yàn)組，孢桿菌屬、顫桿菌克、產(chǎn)琥珀酸菌、梭菌屬IV等纖維分解菌屬的相對(duì)豐度均提高?？赡苡捎趧?dòng)物品種不同，腸道菌群結(jié)構(gòu)不同，但大體結(jié)果一致，都是纖維素分解菌有所增加。梭菌屬IV、梭菌屬XlVa是腸道中重要的丁酸產(chǎn)生菌，與動(dòng)物的生長(zhǎng)有密不可分的關(guān)系，添加膨化秸稈生物發(fā)酵飼料的三個(gè)試驗(yàn)組中丁酸產(chǎn)生菌都有明顯增加。丁酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物丁酸可以為機(jī)體提供一部分能量，保持腸道穩(wěn)態(tài)，具有抗癌癥的功效。以上結(jié)果說明，膨化秸稈生物發(fā)酵飼料會(huì)提高遼育白牛腸道內(nèi)纖維素分解菌、蛋白質(zhì)降解菌、丁酸產(chǎn)生菌等功能菌的數(shù)量，有利于機(jī)體更好地完成對(duì)粗纖維、粗蛋白的消化吸收，同時(shí)使腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。

Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量指標(biāo)有趙氏指數(shù)（Chao1 index）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）和艾斯指數(shù)（Ace index）等。計(jì)算菌群豐度采用趙氏指數(shù)和艾斯指數(shù)，艾斯指數(shù)用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一；計(jì)算菌群多樣性采用香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)，辛普森指數(shù)指數(shù)值越大說明群落多樣性越高，香農(nóng)指數(shù)越大說明群落多樣性越高。王鵬（2015）在育肥豬日糧中添加膨化秸稈生物發(fā)酵飼料，通過PCR-DGGE和高通量測(cè)序檢測(cè)豬直腸內(nèi)的微生物狀況，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組豬腸道微生物的香濃指數(shù)、趙氏指數(shù)增加，表明試驗(yàn)豬腸道內(nèi)微生物的多樣性提高。尹鵬鵬（2012）在肉鴨日糧中添加富含乳酸菌的發(fā)酵飼料，經(jīng)過PCR-DGGE檢測(cè)回腸菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)添加益生菌組條帶數(shù)比對(duì)照組顯著提高，說明添加益生菌發(fā)酵飼料可以較好地保護(hù)腸道內(nèi)微生物的多樣性，但要注意添加量不要過量。本試驗(yàn)對(duì)遼育白牛糞便中菌群進(jìn)行Alpha多樣性比較，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的香濃指數(shù)、艾斯指數(shù)、趙氏指數(shù)較對(duì)照組增加，表明腸道內(nèi)微生物多樣性提高。試驗(yàn)組遼育白牛糞便內(nèi)微生物總數(shù)較對(duì)照組多，微生物多樣性增加。試驗(yàn)2組（70%基礎(chǔ)精料+膨化秸稈生物發(fā)酵飼料飼喂）遼育白牛腸道菌群結(jié)構(gòu)較試驗(yàn)1、3組好、菌群多樣性增加。表明，肉牛日糧內(nèi)添加適量的膨化秸稈生物發(fā)酵飼料可改善腸道菌群的多樣性，有利于肉牛生產(chǎn)性能的提高。