股骨頭壞死血漿軟骨寡肽蛋白的檢測(cè)及臨床意義

龔水帝 黃俊遠(yuǎn) 陳鎮(zhèn)秋 周迎春 劉少軍 魏秋實(shí)

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510405）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（廣州510405）

股骨頭骨壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一種在年輕患者中發(fā)病率較高的頑固性疾病，據(jù)美國(guó)統(tǒng)計(jì)每年就有2萬(wàn)新增的ONFH患者，因?yàn)橹委熯^(guò)程產(chǎn)生的高額費(fèi)用，給世界經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失［1］。目前關(guān)于ONFH的發(fā)病機(jī)制仍未有明確的解釋?zhuān)洳±磉^(guò)程主要是因股骨頭內(nèi)缺血性壞死造成股骨頭的壞死塌陷，并伴有股骨頭軟骨破壞。ONFH以進(jìn)行性股骨頭壞死和髖關(guān)節(jié)退變?yōu)樘卣?，但?jù)統(tǒng)計(jì)，36%的髖關(guān)節(jié)軟骨退變?cè)谟跋駥W(xué)被忽略掉［2］。探討新的血液標(biāo)志物對(duì)診斷ONFH具有重要意義［3］。血漿COMP是一種從軟骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，目前被報(bào)道用于評(píng)估關(guān)節(jié)炎軟骨退變的程度［4］。ONFH進(jìn)程中同樣存在關(guān)節(jié)軟骨的退變，因此，COMP水平的改變可能在ONFH的進(jìn)程中起著重要作用。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)ONFH與血漿COMP的相關(guān)研究，為創(chuàng)新性地探討COMP作為ONFH的血液診斷標(biāo)志物的潛在臨床價(jià)值，本研究對(duì)ONFH患者的COMP表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)與分析。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1試驗(yàn)組納入100例自2016年5月至2016年11月由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科收治的ONFH患者。排除肝腎功能不全、HIV感染、糖尿病、高血壓、癌癥、精神疾患不能配合等患者。

1.1.2對(duì)照組選取同時(shí)間段在本院體檢中心體檢，且年齡、性別匹配的健康者作為對(duì)照組。排除近3個(gè)月使用過(guò)降脂藥物、影響骨代謝藥物、抗焦慮抑郁藥物及激素者。本研究所有納入課題組的人員均簽署了知情同意書(shū)，且經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1血漿的制備與保存試驗(yàn)組及對(duì)照組均于晨起空腹抽取外周靜脈血約5 mL，統(tǒng)一編號(hào)離心后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血漿COMP的檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）開(kāi)發(fā)試劑盒（美國(guó)R&D Systems）測(cè)試血漿COMP水平。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3觀察指標(biāo)（1）ONFH患者血漿COMP與疼痛時(shí)間的相關(guān)性分析。（2）試驗(yàn)組與對(duì)照組血漿COMP水平差異。（3）不同ARCO分期、病因的血漿COMP水平差異。（4）血漿COMP診斷股骨頭壞死塌陷效率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組的性別、年齡資料比較采用卡方檢驗(yàn)；兩組間血漿COMP水平差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同病因、分期間的表達(dá)水平的差異采用單因素方差分析。血漿COMP水平與疼痛時(shí)間、ARCO分期采用Spearman相關(guān)分析。血漿COMP診斷股骨頭壞死塌陷的敏感性及特異性通過(guò)ROC分析比較。以上統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)P＜0.05為表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料對(duì)比試驗(yàn)組納入的ONFH患者共100例，其中男82例，女18例，年齡（42.34±11.68）歲。疼痛時(shí)間為疼痛出現(xiàn)到就診時(shí)間（15.03±14.88）個(gè)月。試驗(yàn)組中創(chuàng)傷性10例，特發(fā)性16例，激素性30例，酒精性44例。試驗(yàn)組經(jīng)ARCO分期所得：Ⅱ期30例，Ⅲ期48例，Ⅳ期22例。對(duì)照組共51例，其中男38例，女13例，年齡（43.13±10.94）歲。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)組與對(duì)照組的一般資料對(duì)比Tab.1 Comparison of general data between test group and control group ± s

表1 試驗(yàn)組與對(duì)照組的一般資料對(duì)比Tab.1 Comparison of general data between test group and control group ± s

項(xiàng)目例數(shù)性別（男/女）年齡（歲）疼痛時(shí)間（月）ARCO分期（例）Ⅱ期/Ⅲ期/Ⅳ期病因分型（例）創(chuàng)傷/特發(fā)/激素/酒精試驗(yàn)組100 82/18 42.34±11.68 15.03±14.88 30/48/22 10/16/30/44對(duì)照組51 38/13 43.13±10.94 P值0.833 0.688

2.2試驗(yàn)組組內(nèi)及與對(duì)照組組間血漿COMP水平比較（1）兩組間血漿COMP水平比較可得：試驗(yàn)組血漿COMP水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）不同ARCO分期、病因間比較得出：①股骨頭壞死不同ARCO分期間血漿COMP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②股骨頭壞死塌陷前后血漿COMP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)Ⅲ期及Ⅳ期患者高于Ⅱ期患者（P＜0.05）。③股骨頭壞死不同病因患者的血漿COMP水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3ONFH患者血漿COMP水平與疼痛時(shí)間相關(guān)性分析結(jié)果血漿COMP水平與疼痛時(shí)間顯著相關(guān)，與其呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.002）。見(jiàn)圖1。

2.4 ONFH患者血漿COMP水平與ARCO分期相關(guān)性分析結(jié)果血漿COMP水平與ARCO分期顯著相關(guān)，與其呈正相關(guān)（r=0.342，P=0.0105）。見(jiàn)圖2。

2.5采用ROC分析血漿COMP診斷塌陷的效率采用MedCalc軟件繪制ROC曲線，可得出區(qū)分塌陷前后的曲線下面積為0.717，敏感性為61.43，特異性為73.33，cut-off值為 ＞ 5.145 ng/mL。說(shuō)明血漿COMP水平在診斷ONFH塌陷時(shí)具有一定的特異性和敏感性。見(jiàn)圖3。

表2 試驗(yàn)組內(nèi)以及與對(duì)照組組間血漿COMP水平比較Tab.2 Comparison of levels of plasma COMP in the test group and with the control group ± s

表2 試驗(yàn)組內(nèi)以及與對(duì)照組組間血漿COMP水平比較Tab.2 Comparison of levels of plasma COMP in the test group and with the control group ± s

注：與Ⅲ期比較，*P＜0.05；與Ⅳ期比較，#P＞0.05；與Ⅱ期比較，**P＜0.05；塌陷后包括Ⅲ、Ⅳ期患者

分組試驗(yàn)組（n=100）對(duì)照組（n=51）ARCO分期Ⅱ期（n=30）Ⅲ期（n=48）Ⅳ期（n=22）塌陷前（n=30）塌陷后（n=70）病因創(chuàng)傷性（n=10）特發(fā)性（n=16）激素性（n=30）酒精性（n=44）濃度（ng/mL）6.132±3.481 4.774±2.358 4.595±2.827 6.735±3.834 6.912±2.889 4.595±2.827 6.790±3.544 4.081±1.900 7.260±4.349 5.456±3.320 6.484±3.314 P值0.005 0.014 0.007*0.839#0.016**0.0034 0.102

圖1 血漿COMP水平與股骨頭壞死疼痛時(shí)間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between the level of COMP in Plasma and pain duration of femoral head Necrosis

圖2 血漿COMP水平與股骨頭壞死ARCO分期的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the level of COMP in Plasma and ARCO stage of femoral head Necrosis

圖3 血漿COMP水平在診斷ONFH塌陷時(shí)的敏感性和特異性Fig.3 Sensitivity and specificity of levels of plasma COMP in the diagnosis of femoral head necrosis collapse

3 討論

3.1 COMP對(duì)ONFH的潛在診斷價(jià)值ONFH的主要特點(diǎn)是血液供應(yīng)不足導(dǎo)致骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞死亡以及股骨頭進(jìn)行性塌陷。晚期的壞死導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎，可通過(guò)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的治療，重新獲得較好的關(guān)節(jié)功能。目前，ONFH的晚期患者占所有THA手術(shù)的10%［5］，給患者及其家庭帶來(lái)了巨大的損失。早期的ONFH診斷一直是關(guān)節(jié)骨科醫(yī)生研究的重要課題，目前公認(rèn)的診斷方式主要是MRI［6］，但存在價(jià)格高，患者復(fù)查依從性較低等缺點(diǎn)，所以需要一種簡(jiǎn)便可行的新型早期診斷方式，為此探討生化標(biāo)志物的診斷效率成為早期ONFH的重要課題。

3.2軟骨細(xì)胞與COMP的關(guān)系探討光滑的軟骨表面可以有效降低活動(dòng)時(shí)的摩擦系數(shù)，減少關(guān)節(jié)間的磨損，避免關(guān)節(jié)軟骨損耗。ONFH中軟骨的退變機(jī)制最初始于缺血性骨損傷，但軟骨退變主要發(fā)生在股骨頭塌陷后［7］。一些研究表明軟骨細(xì)胞凋亡與關(guān)節(jié)軟骨退化的發(fā)生和嚴(yán)重程度成正相關(guān)［8］。

血漿COMP是軟骨細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在軟骨、成纖維細(xì)胞、肌腱、韌帶等不同組織中均有表達(dá)［9］。不同原因造成的關(guān)節(jié)軟骨損傷可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝失衡［10］。其中軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）為軟骨細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)，使得軟骨細(xì)胞具有彈性及對(duì)壓力有抵抗性。ECM-受體是一種跨膜蛋白復(fù)合物，通過(guò)局灶性黏附使細(xì)胞骨架與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器保持建立多重連接。此外，有研究表明在ONFH中的局灶性黏附也明顯增加。COMP作為連接蛋白及其激活周?chē)煞值臉蛄悍肿樱嘧鳛榈鞍踪|(zhì)與細(xì)胞表面之間的連接分子。COMP可與ECM的不同組分相結(jié)合，其特殊的活性使之具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的附著、增殖和分化等重要功能［11］。因此，可以推測(cè)，較高水平的COMP通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)中的局灶性黏附促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而加速破壞了關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步促進(jìn)股骨頭的塌陷［4］。在ONFH的過(guò)程中發(fā)生了軟骨損傷，軟骨細(xì)胞的凋亡也進(jìn)一步加劇了軟骨的退化，增加了塌陷的危險(xiǎn)，從而形成了一個(gè)惡性循環(huán)。由此可得，COMP在軟骨細(xì)胞代謝中起著重要的作用，并且在ONFH塌陷過(guò)程中具有重要影響及預(yù)測(cè)的能力。

3.3ONFH患者的疼痛時(shí)間與COMP水平的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn)COMP與疼痛持續(xù)時(shí)間成正相關(guān)，據(jù)何偉［12］多年臨床發(fā)現(xiàn)“疼痛-不塌（穩(wěn)定）不痛，一塌（不穩(wěn)）必痛”的理論。疼痛往往意味著塌陷即將出現(xiàn)，此時(shí)隨著機(jī)體對(duì)壞死的修復(fù)，活骨與死骨間出現(xiàn)骨小梁斷裂帶，在應(yīng)力作用下進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨下骨板的斷裂。所以疼痛發(fā)生提示髖關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定或塌陷發(fā)生，疼痛發(fā)生的時(shí)間可以推測(cè)股骨頭不穩(wěn)定或塌陷發(fā)生的時(shí)間，塌陷過(guò)程中存在關(guān)節(jié)軟骨退變，并且隨著時(shí)間推移，軟骨破壞持續(xù)性增加，由此推斷疼痛的持續(xù)時(shí)間可反映了股骨頭塌陷的程度，并且反映軟骨退變的進(jìn)展程度，本研究中COMP水平與疼痛時(shí)間呈正相關(guān)，亦從側(cè)面反映出COMP可預(yù)測(cè)股骨頭塌陷進(jìn)程。當(dāng)股骨頭壞死能在生化標(biāo)記物的輔助下進(jìn)行早期診斷，同樣可以較好把握保髖時(shí)機(jī)，我們?cè)O(shè)想COMP與疼痛持續(xù)時(shí)間成正相關(guān)，并且疼痛持續(xù)時(shí)間在一定程度上反映出塌陷的進(jìn)程，那么可以建立COMP預(yù)測(cè)塌陷的進(jìn)展，臨床上，疼痛≤6個(gè)月的患者是保髖治療的黃金時(shí)期。針對(duì)未塌陷者，即沒(méi)有疼痛患者，可采用非手術(shù)的保守治療，包括避免負(fù)重，中西藥物治療，體外沖擊波等物理療法等。

本研究旨在探討ONFH患者的COMP水平與疼痛時(shí)間、疾病分期、病因的關(guān)系。在此次研究中，不同的疼痛時(shí)間與COMP水平呈正相關(guān)，但不同病因的ONFH患者的COMP水平無(wú)明顯差異，這可能是因?yàn)橛刹煌蛩鼐梢鸬能浌羌?xì)胞凋亡［13］。ONFH患者COMP水平明顯高于對(duì)照組，尤其是塌陷后組對(duì)比塌陷前組明顯增高，并且COMP水平的持續(xù)升高與ACRO分期呈正相關(guān)。目前尚未有研究對(duì)COMP與ONFH的進(jìn)展程度進(jìn)行相關(guān)分析，因?yàn)閺谋狙芯恐械贸鯟OMP可以作為評(píng)估股骨頭塌陷的生物標(biāo)志物。

綜上所述，COMP的表達(dá)增加可能在ONFH的塌陷過(guò)程中具有重要意義，其在與疾病疼痛持續(xù)時(shí)間、不同分期成正相關(guān)，且塌陷后COMP水平明顯高于塌陷前，可作為評(píng)價(jià)ONFH病情進(jìn)展和指導(dǎo)臨床治療的敏感指標(biāo)之一，但其更多的機(jī)制及實(shí)用性仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索及臨床驗(yàn)證。