腦梗死患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性與同型半胱氨酸水平的相關(guān)性

朱嫦琳 陳斌鴻 薛雄燕 潘練華 李煒煊

佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東佛山528000）

腦梗死是最常見的腦血管疾病之一，其發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，除了常見的高血壓、高血脂等因素外，血液中同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高是腦梗死發(fā)生的獨(dú)立危險因素［1-2］。Hcy在體內(nèi)的代謝受亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）的調(diào)節(jié)。MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，具有單核苷酸多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)的變化可導(dǎo)致其編碼的酶活性發(fā)生改變，引起血清葉酸水平異常，從而導(dǎo)致Hcy水平升高［3］。本研究通過分析腦梗死患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性分布特點(diǎn)，并比較糖尿病性腦梗死患者和非糖尿病性腦梗死患者血漿Hcy水平的差異，明確腦梗死患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性與Hcy水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料病例組256例腦梗死患者選自2016年6月至2018年5月佛山市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及康復(fù)醫(yī)學(xué)病區(qū)，男174例，女82例，年齡29～92歲，平均（65.9±11.3）歲。糖尿病性腦梗死患者68例，非糖尿病性腦梗死患者188例。對照組208例為同期體檢者，男145例，女63例，年齡28～89歲，平均（64.1±10.8）歲。兩組對象在年齡和性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有研究對象或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

針對難以坐位的患兒,患兒家長要抱著患兒,促使膈肌下移,促使患兒氣體交換量增加,便于霧化液滴在終末細(xì)支氣管內(nèi)沉降。在吸入過程中,教導(dǎo)患兒緩慢地進(jìn)行深呼吸,如果患兒不能學(xué)會這種呼吸方式,則教導(dǎo)其張口呼吸。在患兒在治療過程中,護(hù)理人員要對患兒的面色、表情以及情緒進(jìn)行密切觀察,一旦發(fā)現(xiàn)患兒異常狀況,要及時告知醫(yī)生并采取方式處理。

這些問題我們是解答不了的，因?yàn)槌税磿菊鹿?jié)背了一些理論外，其他就不甚了了。巴克夏被問得支支吾吾，滿頭冒汗，求援似的望著我。我靈機(jī)一動，連忙遮掩：“大家問的都是關(guān)于農(nóng)作物的疾病與蟲害部分，將來會講到的，現(xiàn)在暫不涉及——”

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)病例組患者均符合1995年全國第四屆腦血管會議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，其中糖尿病性腦梗死患者均符合2016年ADA糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，并排除惡性腫瘤、外周靜脈血栓疾病、嚴(yán)重肝腎疾病及代謝性疾病等。對照組人群除符合以上排除標(biāo)準(zhǔn)外，還排除所有腦梗死、冠心病、糖尿病患者。所有研究對象之間均無直系血緣關(guān)系。

腦梗死的發(fā)生發(fā)展受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，包括高血壓、糖尿病、高脂血癥、飲食不當(dāng)、飲酒過量、過度的精神壓力等。目前關(guān)于腦梗死的研究眾多，有研究指出，MTHFR基因多態(tài)性與腦梗死具有一定相關(guān)性［6-7］。MTHFR基因C677T位點(diǎn)可發(fā)生突變，胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，使MTHFR活性和耐熱性下降，引起血清葉酸水平異常，進(jìn)而導(dǎo)致高Hcy血癥，在血栓性疾病中起著重要的作用。

2.1病例組與對照組MTHFR基因C677T位點(diǎn)的基因分型對病例組和對照組的MTHFR基因C677T位點(diǎn)的3種基因型分布進(jìn)行Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)，符合遺傳平衡法則（P＞0.05），說明樣本具有代表性。兩組間基因分型比較結(jié)果顯示，在256例腦梗死患者中，CC型136例（53.1%），CT型89例（34.8%），TT型31例（12.1%），208例對照者中，CC型136例（65.4%），CT型64例（30.8%），TT型8例（3.8%），兩組間MTHFR基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝12.821，P ＜ 0.001），其中病例組TT型的比例顯著高于對照組（χ2＝10.178，P＝0.001），CC型的比例則顯著低于對照組（χ2＝7.111，P＝0.008）。病例組C和T等位基因頻率分別為70.5%、29.5%，與對照組（分別為80.8%、19.2%）基因頻率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝12.927，P ＜ 0.001）。見表1。

1.4儀器和試劑所有對象在清晨空腹采取靜脈血，其中，EDTA-K2抗凝管采集全血2 mL用于MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測，綠色肝素鈉抗凝管采集全血2 mL后經(jīng)3 500 r/min離心15 min，分離上層血漿用于Hcy檢測。亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T檢測試劑盒（PCR-RFLP）購自深圳市奧薩制藥有限公司，檢測儀器為ABI公司7500熒光實(shí)時定量PCR儀。Hcy檢測采用Siemens公司ADVIA2400全自動生化分析儀及配套試劑。所有操作嚴(yán)格按照說明書。

2.3 病例組與對照組不同MTHFR基因型的Hcy水平比較結(jié)果顯示，病例組腦梗死患者總體血漿Hcy水平以及各基因型患者的血漿Hcy水平均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對不同基因型研究對象間的Hcy水平的比較結(jié)果顯示，病例組TT型患者的Hcy水平顯著高于CC型及CT型（F＝26.291，P＜0.001），而病例組CC型和CT型之間、以及對照組各基因型間Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

1.3檢測原理MTHFR基因C677T多態(tài)性采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物由識別多態(tài)性位點(diǎn)的特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切片段經(jīng)電泳分析，根據(jù)電泳條帶區(qū)分基因型；血漿Hcy采用循環(huán)酶法檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。等位基因頻率的Hardy-Weinberg（HW）平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，兩組間的基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，計量資料符合正態(tài)分布，兩組間Hcy水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同基因型之間Hcy水平比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

(2)阻垢劑靜態(tài)阻垢實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)參照Q/SY 126-2014《油田水處理用緩蝕阻垢劑技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行。利用靜態(tài)阻垢法測定兩種阻垢劑對CaCO3垢的阻垢性能，同時做2組空白試驗(yàn)。

2.4 糖尿病腦梗死患者與非糖尿病腦梗死患者不同MTHFR基因型的Hcy水平比較結(jié)果顯示，糖尿病腦梗死患者血漿Hcy平均水平低于非糖尿病腦梗死患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝1.578，P＝0.116），其中糖尿病腦梗死組TT型患者血漿Hcy水平顯著低于非糖尿病腦梗死組（t＝2.929，P＝0.007），而兩組CC型和CT型患者血漿Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表1 病例組與對照組MTHFR基因C677T位點(diǎn)的基因分型比較Tab.1 Comparison of MTHFR gene C677T polymorphism between case group and control group 例（%）

表2 糖尿病腦梗死患者與非糖尿病腦梗死患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)的基因分型比較Tab.2 Comparison of MTHFR gene C677T polymorphism in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus 例（%）

2.2.1建成區(qū)擴(kuò)展數(shù)量和強(qiáng)度德州市主要建成區(qū)從1997年的85.39 km2增加到2017年的151.56 km2，凈增長面積達(dá)66.17 km2，增加了1.77倍，平均年增長3.30 km2（見表2）．

表3 病例組與對照組不同MTHFR基因型的Hcy水平Tab.3 Homocysteine levels in case group and control group±s，μmol/L

表3 病例組與對照組不同MTHFR基因型的Hcy水平Tab.3 Homocysteine levels in case group and control group±s，μmol/L

組別病例組對照組t值P值例數(shù)256 204 Hcy 15.6±6.5 9.4±4.5 11.588＜0.001各基因型的Hcy CC 14.9±5.2 9.2±4.2 9.944＜0.001 CT 15.1±5.8 9.6±4.4 6.378＜0.001 TT 22.8±11.7 11.2±6.8 2.673 0.011

2.2糖尿病腦梗死患者與非糖尿病腦梗死患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)的基因分型表2顯示，在68例糖尿病腦梗死患者中，CC型26例（38.2%），CT型25例（36.8%），TT型17例（25.0%），而在188例非糖尿病腦梗死患者中，CC型110例（58.5%），CT型64例（34.0%），TT型14例（7.4%），兩組間分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝16.667，P＜0.001），其中糖尿病腦梗死組TT型的比例顯著高于非糖尿病腦梗死組（χ2＝14.457，P＜ 0.001），CC型的比例則顯著低于非糖尿病腦梗死組（χ2＝8.244，P＝0.004），兩組間CT型所占比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.163，P＝0.686）。糖尿病腦梗死組C等位基因頻率顯著低于非糖尿病腦梗死組（56.6%vs.75.5%），T等位基因則顯著高于非糖尿病腦梗死組（43.4%vs.24.5%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝17.183，P＜ 0.001）。

表4 糖尿病腦梗死患者與非糖尿病腦梗死患者M(jìn)THFR基因型與Hcy水平相關(guān)性Tab.4 Correlation between MTHFR genotype and homocysteine levels in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus ±s，μmol/L

表4 糖尿病腦梗死患者與非糖尿病腦梗死患者M(jìn)THFR基因型與Hcy水平相關(guān)性Tab.4 Correlation between MTHFR genotype and homocysteine levels in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus ±s，μmol/L

組別糖尿病腦梗死組非糖尿病腦梗死組t值P值例數(shù)68 188 Hcy 14.5±5.0 16.0±6.9 1.578 0.116各基因型的Hcy CC 14.3±5.5 15.1±5.1 0.709 0.480 CT 14.4±4.5 14.7±5.7 0.262 0.793 TT 16.3±4.3 26.1±13.0 2.929 0.007

3 討論

(2)從混合式教學(xué)在中小學(xué)領(lǐng)域研究文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞可視化分析可以看出，研究的熱門關(guān)鍵詞為“混合式學(xué)習(xí)”、“混合式培訓(xùn)”、“中小學(xué)教師”、“教學(xué)設(shè)計”、“混合式教學(xué)”等，但是詞與詞之間的結(jié)構(gòu)不是很緊密，詞之間的關(guān)聯(lián)性也不夠，形成的緊密度也不高。

本研究對腦梗死患者及健康體檢者的MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩組均為CC型所占比例最高，TT型最低，與文獻(xiàn)［8-9］報道的以CT型比例最高不一致，可能與研究所納入人群的遺傳背景不一致有關(guān)，提示MTHFR基因多態(tài)性有著明顯的地域差別［10-11］。對病例組和對照組人群MTHFR基因多態(tài)性比較結(jié)果顯示，兩組多態(tài)性分布存在顯著差異，其中病例組TT型比例顯著升高，CC型比例則顯著降低，